小鼠口服五氯柳胺混悬剂的急性毒性研究

张吉丽++司鸿飞++李冰++程富胜++周绪正+张继瑜

摘要：通过进行小鼠急性毒性试验，对五氯柳胺混悬剂的安全性进行初步评价。预试验采用递增法确定给药的剂量范围、正式试验分组以及组距等。正式试验按照简化寇氏法进行，观察给药后小鼠的体征变化，统计死亡率，记录死亡时间，计算五氯柳胺混悬剂的半致死剂量（LD50）以及95%的可信限。结果表明，小鼠口服五氯柳胺混悬剂的LD50值为1.679 g/kg，95%的置信区间为1.439～1.947 g/kg，按照化学物毒性分级可得：五氯柳胺混悬剂为低毒物质。

关键词：五氯柳胺混悬剂；小鼠；急性毒性试验；半致死剂量（LD50）

中图分类号： S855.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0340-02

收稿日期：2016-01-14

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2015BAD1101）；国家现代农业产业技术体系专项（编号：CAR-38）。

作者简介：张吉丽（1992—），女，黑龙江大庆人，硕士，研究方向为动物抗寄生虫药。E-mail：zhangjlzjl@sina.com。

通信作者：张继瑜，研究员，博士生导师，研究方向为兽医药理学与毒理学。E-mail：infzjy@sina.com。五氯柳胺是广谱高效的水杨酰苯胺类化学合成抗寄生虫药物，主要用于治疗牛、羊的肝片吸虫感染，在抗绦虫、线虫等方面也具有较好的治疗效果[1]。自20世纪中后期报道其抗虫活性后，国外对其进行了大量研究，并相继报道了五氯柳胺在临床试验中显著的治疗效果[2-3]。国内并未对其进行系统性研究，相关报道较少。因其水溶性差，有一定的毒性，限制了其临床应用。五氯柳胺混悬剂，克服了五氯柳胺的难溶性，且性质稳定、质量可控、治疗效果确切，本研究采用改良寇氏法进行小鼠的急性毒性试验，从而评价五氯柳胺混悬剂的安全性。

1材料与方法

1.1试验动物

SPF级昆明系小鼠110只，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。体质量在18～22 g之间，雌雄各半，雌性未产未孕。试验前饲养3～5 d，自由饮水觅食，以适应试验环境。

1.2供试药品

五氯柳胺口服混悬剂，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部新兽药工程重点实验室制备。试验前，精确称定处方中主药及辅料，配制成0.209 g/mL的混悬剂，待用。按照处方中各辅料的用料配比，配制辅料对照组的浓度为 0.100 g/mL。

1.3预试验

本试验采用递加法分别对五氯柳胺混悬剂组以及辅料对照组进行预试验。

五氯柳胺混悬剂预试验组：将20只SPF级昆明系小鼠，随机分为5组，每组4只，雌雄各半，分别给小鼠称体质量，计算给药剂量。最高剂量组给药量为3.375 g/kg体质量，最低剂量组给药量为1.000 g/kg体质量。灌胃给药，观察7 d，记录小鼠的死亡数，确定最小致死剂量（LD100）和最大耐受剂量（LD0）。从而确定正式试验组数（N）以及各组间剂量比（r）。

辅料对照组预试验同样采用20只SPF级昆明系小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组4只，分别给小鼠称体质量，计算给药剂量。最高给药剂量为5.000 g/kg体质量，最低给药剂量为1.000 g/kg体质量。记录死亡数，确定最小致死剂量（LD100）和最大耐受剂量（LD0）。

1.4正式试验

根据预试验得到的最小致死剂量（LD100）和最大耐受剂量（LD0），采用简化寇氏法计算正式试验组数（N）以及各组间剂量比（r）。由于辅料试验的LD100值大于5.000 g/kg体质量，将小鼠样本量增至10只，雌雄各半，仍未出现死亡现象，按照化学药物毒性分级，可以得到结论：混悬剂辅料实际无毒。

根据五氯柳胺混悬剂预试验结果将正式试验分为6组，包括空白对照组和5个不同剂量试验组。将60只小鼠，雌雄各半，体质量为18～22 g，随机分为6组，试验组的给药剂量为：3.375、2.488、1.836、1.355、1.000 g/kg体质量。空白对照组给予等量的饮用水。灌胃给药，观察7 d，观察给药后小鼠的外观体征、采食状况、行为活动等相关症状，记录每组小鼠死亡数、死亡时间，并对死亡小鼠进行剖检，观察病理变化。用改良寇氏法计算LD50以及95%的置信区间。

2结果与分析

2.1预试验结果

由预试验可得：辅料预试验组的LD0大于5.000 g/kg，增加试验动物数量至10只，仍未出现死亡现象，按照化学药物的毒性分级可以视为混悬剂辅料实际无毒。

五氯柳胺混悬剂预试验组的LD100为3.375 g/kg，LD0为1.000 g/kg。从而确定正式试验的组数（N）为5。各组之间的剂量比值为r=1.355。由此将预试验分为6组，其中包括不同剂量试验组5组以及空白对照组。

2.2正式试验结果

观察给药后动物表现出的症状为：给药后出现精神沉郁、伏卧不动、眼睛微闭、被毛凌乱、食欲减退，给药3.5 h后出现死亡现象，死亡时间集中在5～12 h，死亡前出现全身震颤、侧翻现象，大约持续5 min死亡。剖检未见明显的病理变化。给药36 h后，再无死亡现象，但高剂量组存活小鼠依然表现为精神沉郁，3 d后逐渐恢复饮食饮水。将存活小鼠体质量变化与空白组对比可以发现，给药组小鼠增长缓慢。

五氯柳胺混悬剂试验组的死亡数见表1，根据死亡情况计

算五氯柳胺口服混悬剂的LD50以及95%的可信度区间如下：

LD50=lg-1[Xm-i（∑p-0.5）]

Sx50=i（∑pq/n），

LD50的95%可信限=lg-1（lgLD50±1.96×Sx50）。

式中：Xm为最大剂量的对数；i为组距，相邻两组剂量对数值之差；p为各剂量组死亡率；q为各剂量组存活率；n为各组动物数；Sx50为lgLD50的标准误差。

经计算得五氯柳胺口服混悬剂的LD50为1.674 g/kg，95%的可信度区间为1.439～1.947 g/kg。

3讨论与结论

为了保证试验动物本身清洁无污染，有效地消除试验动物本身造成的试验误差，本研究选用SPF级昆明系小鼠。在整个试验过程中，严格按照《兽药研究技术指导原则汇编》中关于化学物急性毒性相关的试验指导原则[4]进行。在给药过程中，严格按照灌胃给药的操作，以防由于灌胃方法不当导致小鼠死亡，影响试验结果的准确性。

由于配制五氯柳胺混悬剂的母液浓度为0.209 g/mL，遵照《兽药研究技术指导原则汇编》中关于小鼠受试物给药体积的相关规定为：小鼠1次给药量为每10 g体质量给药量在0.1～0.2 mL之间。所以在给药过程中，为了避免给药体积过大，需要进行多次给药，2次给药时间间隔为1～2 h，1次给药体积不得超过0.4 mL，防止小鼠因灌胃受试物的体积过大而撑死。

寄生虫作为一类重要的病原，严重危害人类和畜禽的健康，造成了畜牧养殖业的重大损失。动物抗寄生虫药物是预防和治疗寄生虫类疾病、保障畜牧业健康发展和公共卫生安全的最有效手段。五氯柳胺是一种广谱抗寄生虫类化学合成药物，是临床抗寄生虫的首选。为了满足兽医临床对五氯柳胺的需求，本研究研制了五氯柳胺的口服混悬剂，并对其急性毒性进行了评价。由试验结果可知：五氯柳胺口服混悬剂的LD50为1.674 g/kg，95%的可信度区间为1.439～1.947 g/kg，这为五氯柳胺混悬剂后续研究及临床推广奠定了基础。

参考文献：

[1]崔莹. 驱虫药五氯柳胺的制备[J]. 现代商贸工业，2010，22（20）：300-300.

[2]Sanabria R，Moreno L，Alvarez L，et al. Efficacy of oxyclozanide against adult Paramphistomum leydeni in naturally infected sheep[J]. Veterinary Parasitology，2014，206（3/4）：277-281.

[3]Arias M S，Sanchis J，Francisco I，et al. The efficacy of four anthelmintics againist Calicophoron daubneyi in naturally infected dairy catlle[J]. Veterinary Parasitology，2013，197：126-129.

[4]农业部兽药评审中心. 兽药研究技术指导原则汇编[M]. 北京：化学工业出版社，2012