小麦高蛋白含量基因与部分优质基因的聚合研究

胡云 徐如宏++程剑平

摘要：利用分子标记辅助选择与传统育种相结合的方法，将来自美国的小麦高蛋白基因GPC-B1与抗白粉病基因Pm21，优质亚基1Dx5、1Dy10等优良基因聚合到同一植株。首先将携带高蛋白含量基因GPC-B1小麦分别与抗白粉病基因Pm21、优质亚基1Dx5、1Dy10小麦杂交得到F2，利用分子标记辅助选择对亲本及杂交后代进行筛选，结合小麦抗病性鉴定、小麦籽粒蛋白质含量测定等方法对结果做进一步鉴定。结果发现，F2群体中100个株系中有6株聚合了GPC-B1、Pm21、1Dx5、1Dy10 4种基因，11株聚合高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21，8株聚合了GPC-B1和5+10亚基。本研究为培育具有高蛋白含量及多个优质基因的小麦优良品系提供了育种材料和理论依据。

关键词：小麦；优质；基因；聚合；高蛋白

中图分类号： S512.103文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0050-03

收稿日期：2015-05-13

基金项目：贵州省省长基金 （编号：2005175）。

作者简介：胡云（1982—），女，贵州织金人，讲师，从事作物遗传育种研究。E-mail：705498263@qq.com。

通信作者：徐如宏，教授，硕士生导师，从事小麦遗传育种及分子标记研究，E-mail：xrhgz@163.com；程剑平，教授，博士生导师，从事野生麦类作物和我国西南岩溶地区石漠化综合治理研究，E-mail：chengjianping@gmail.com。传统育种技术通常受环境条件和显隐性关系等因素的影响，存在效率低、选择时间长等缺点。分子标记辅助选择则可降低育种盲目性、缩短育种时间、提高选择效率[1-2]。在聚合育种方面，相关报道并不少见，如通过聚合育种获得了带有抗白粉病基因Pm2+Pm4a，Pm4a+Pm21的新品系[3-4]，以及具有优质亚基HNW-GS 1、14+15、5+10的聚合体[5-8]。但是，相关报道基本上是针对不同基因控制的同一表现性状，而本研究是利用传统育种和分子标记辅助选择相结合的方法，将高蛋白含量基因GPC-B1、抗白粉病基因Pm21以及优质亚基1Dx5和1Dy10等控制不同性状的优良基因进行杂交，选育出聚合有GPC-B1、Pm21、1Dx5和1Dy10等优质基因的植株，为小麦选育优良种质资源提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

本研究选用11个试验小麦材料，详见表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用CTAB法[9]提取小麦亲本、杂交F1总DNA，以及100个F2抗病单株的DNA。待小麦长至3～4片叶时，取0.2 g新鲜幼嫩叶片放入研钵中，加入750 μL的提取缓冲液磨碎，缓冲液为50 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L Tris-HCl，2% CTAB，100 mmol/L NaCl；倒入1.5 mL 离心管65 ℃下水浴1 h，其间上下颠倒2次；加入等体积的氯仿-异戊醇（24 ∶ 1），混匀10 min，18 ℃、13 000 r/min 冷冻离心机内离心10 min；取上清液放入1.5 mL 离心管中，加入750 μL异丙醇混匀10 min；去上清液，加入1 mL 70%乙醇清洗DNA，室温下放置5～10 min，7 500 r/min 离心5 min，去上清液、干燥。加入100 μL 0.1×TE混匀，37 ℃下水浴1 h，取2 μL总DNA，1%琼脂糖电泳检测其纯度和浓度。其余DNA在4 ℃条件下保存。

1.2.2小麦优质基因的分子标记辅助选择（1）小麦高蛋白基因的SSR分析。与高蛋白基因GPC-B1连锁的特异引物为Xuhw89[9]，其序列为：UHW89-BF：5′-TCTCCAAGAGGGGAGAGACA-3′，UHW89-R：5′-TTCCTCTACCCATGAATCTAGCA-3′。特异引物UHW89-BF、UHW89-R扩增多态性标记为SSR122。所有PCR反应都在Perkin-Thermocycle 480上进行，反应总体积为20 μL。SSR反应体系中含有10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.8），50 mmol/L KCl；2 mmol/L MgCl2；100 μmol/L dNTP；0.5 μmol/L 特异引物；1U Taq DNA聚合酶（上述药品均购自上海生工生物工程技术服务有限公司）；50～100 ng模板DNA，加ddH2O至终体积 20 μL。加1滴矿物油覆盖后进行扩增。反应条件为94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72℃ 2 min，循环40次；最后 72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。

（2）小麦抗白粉病基因的SCAR分析。与Pm21基因连锁的SCAR引物序列：D-R： 5′-CCTCGTTGTCAGCCTCTATG-3′，D-L：5′-CTATGGAGTATCAATACGACTCCT-3′。 其扩增多态性标记SCAR140。SCAR反应体系中含有 10 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.8），50 mmol/L KCl；2 mmol/L MgCl2；100 μmol/L dNTP；0.5 μmol/L 特异引物；1 U Taq DNA聚合酶；50～100 ng模板DNA，加ddH2O至终体积20 μL。加1滴矿物油覆盖后进行扩增。反应条件为94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72℃ 2 min，循环40次；最后 72 ℃ 延伸 5 min，4 ℃保存。

（3）小麦高分子量谷蛋白亚基的PCR分析[10-15]。1对Glu-D1y位点的特异引物设计[7]，其序列为：10S-1：5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，10S-2：5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；与Glu-D1x位点连锁的特异引物序列为：P1：5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P2：5′-GAAACCTGCTGCGGACAAGT-3′。1Dx5基因扩增片段为450 bp，1Dy10基因扩增片段为576 bp。扩增程序同上。

1.2.3小麦白粉病的抗性鉴定参照徐如宏等的方法[5]。当感病对照莱州137发病严重时对田间所有小麦植株进行白粉病抗性鉴定和记录。

1.2.4小麦籽粒蛋白质含量的测定采用微量凯氏定氮法测定小麦籽粒的蛋白质含量。准确称取0.1 g干燥样品3份于50 mL消化管内，加0.5 g催化剂（硫酸钾 ∶ 硫酸铜=3 ∶ 1）、5 mL 30%过氧化氢-浓硫酸-蒸馏水（3 ∶ 2 ∶ 1）混合液。稍加振荡，斜置于电炉上，在通风橱内进行消化；消化到溶液显浅蓝绿色的透明状时，继续加热沸腾10 min。撤离热源，待消化液冷却至室温后，加水10～20 mL，待溶液温度降至室温后，转入100 mL的容量瓶中，加水稀释到刻度混匀备用。然后用Foss kjeltecTM2200型全自动凯氏定氮仪测定。

2结果与分析

2.1小麦高蛋白含量基因GPC-B1的SSR标记

引物Xuhw89 在122 bp的位置显示特征带，4个小麦高蛋白材料都在同一位置出现了1条特征DNA片段。对照材料莱州137和其他5个贵州地方小麦材料都不具有此特征带（图1）。再对F2群体的100个单株进行检测，其中76株中检测出携带GPC基因，24株未检测出特异带（图2）。

2.2Glu-1位点等位基因的PCR检测

2.2.1小麦优质亚基1Dx5特异PCR标记对F2群体的

100个单株进行检测，其中在38株中未检测出特异带，62株中检测出携带1Dx5基因（图3）。1Dx5亚基引物的特异性较强，可用作1Dx5基因的PCR检测。

2.2.21Dy10亚基特异PCR标记对F2群体的100个单株进行检测），其中42个样本株中检测出携带1Dy10基因，58株中未检测出特异带（图4）。对HWM-GS基因检测结果表现为共显性（10亚基的PCR标记）或显性（5亚基的PCR标记），与梁荣奇等的研究结果[15]一致。

2.3抗白粉病基因的SCAR标记

对F2群体中100个单株进行抗白粉病基因Pm21分子标记检测，结果见图5和表2。具有抗病标记的单株有78株，无特异标记的有22个单株。在F2群体中，抗白粉病性状呈现近3 ∶ 1的比例，表明了抗白粉病基因Pm21是显性单基

因控制的遗传。

2.4小麦白粉病抗性鉴定

为验证小麦抗白粉病基因分子标记结果，对亲本材料及F2群体中的100个单株分别进行了田间白粉病抗性鉴定。鉴定结果表明，亲本材料中除X-2003、贵农775、贵农17号、贵农21、laura×贵农21 F1对白粉病免疫以外，莱州137和4份高蛋白材料A-GPC、R-GPC、PF638741、PI638740均感病。另外，PI638740的成熟期比其他研究材料提前1周左右；F2群体中100个单株的白粉病抗性见表2（此处仅列出前20个单株的鉴定结果）。

在F2群体中的100个单株中，同时具有5+10亚基、高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21标记的单株有6株；同时有高蛋白基因、抗白粉病基因标记的有11株；具有高蛋白基因GPC-B1和5+10亚基的群体为8 株。

2.5小麦籽粒蛋白质含量的测定

用微量凯氏定氮法对供试材料进行蛋白质含量的测定（表3）。 7个母本材料中小麦蛋白质含量在13.05%～1861%，平均含量16.55%。4个父本中PI638740的蛋白质含量比另外3个材料较高，为20.41%；其余3个高蛋白材料比部分贵州当地材料的蛋白质含量低，而分子标记的结果表明它们均含有高蛋白含量基因GPC-B1，这可能是由于地理、气候等方面的因素所致，使其性状未表达。在4组杂交F1中，小麦籽粒蛋白质含量有的在2个亲本之间，有的比蛋白质含量最低的亲本稍小。

3讨论

本研究表明，来自美国的高蛋白材料PI638740不仅蛋白质含量比贵州当地小麦高，而且其成熟期也提前1周左右[8-13]。对于4个携带高蛋白基因的育种材料而言，综合其分子标记辅助选择、小麦籽粒蛋白质含量的测定、抗病性鉴定以及成熟时间来看，在今后的小麦育种过程中，我们将首选PI638740作为父本材料来进行下一步的聚合研究。蛋白质含量低一直是贵州小麦品质发展的一个瓶颈，GPC基因是小麦育种者眼中的一个亮点，是提高贵州小麦蛋白质含量的一个宝贵资源，将其转育到具有优质基因的小麦种质中是一个重要育种目标，有望进一步改善贵州小麦的营养价值，以逐渐符合人们对小麦越来越高的饮食要求。

在本研究中，利用分子标记辅助选择和多基因聚合研究相结合，快速准确鉴别所需转移的目的基因，对选育优质、高蛋白质、抗病的小麦品种（系）具有重要意义。跟传统育种技术相比，分子标记技术在育种过程中不仅可以对早代材料的目的基因进行选择，并且还能快速掌握亲本的育种特点，对其选择适合的杂交方式如回交、复交等，可缩短育种年限，大大提高育种效率，加快品种的繁育速度。

本研究通过传统育种技术和分子标记相结合的育种方式，将控制高蛋白含量的基因GPC-B1、与烘烤品质有关的优质亚基1Dx5、1Dy10和抗白粉病基因Pm21中的2个或2个以上的基因聚合到同一植株中，为培育贵州小麦新品系提供了重要育种材料和理论依据。

参考文献：

[1]Tansley S D，Yong N D，Paterson A H，et al. RFLP mapping in plant breeding new tools for old science[J]. Biotechnology，1989，7（3）：257-264.

[2]刘景芳，张增艳，陈孝，等. 小麦抗白粉病基因Pm13及Pm4累加体的分子标记辅助选择[J]. 植物病理学报，2002，32（4）：296-300.

[3]王心宇，陈佩度，张守忠. 小麦白粉病抗性基因的聚合及其分子标记辅助选择[J]. 遗传学报，2001，28（7）：640-646.

[4]张增艳，陈孝，张超，等. 分子标记选择小麦抗白粉病基因Pm4b、Pm13和Pm21聚合体[J]. 中国农业科学，2002，35（7）：789-793.

[5]徐如宏，任明见，黄世全，等. 小麦抗病种质贵农775中抗白粉病基因的RAPD标记[J]. 作物学报，2005，31（2）：243-247.

[6]徐如宏，张庆勤. 贵农系列高产，多抗小麦新材料中HMW-GS的组成研究[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2003：193-197.

[7]孙辉，刘志勇，李保云，等. 利用PCR技术鉴定普通小麦Glu-1位点的某些等位基因[J]. 作物学报，2002，28（6）：734-737.

[8]Smith R L，Schweder M C，Bamett R D. Identification of glutenin alleles in wheat and tritical using PCR-generated DNA markers[J]. Crop Science，1994，34（5）：1373-1378.

[9]胡云，徐如宏. 小麦高蛋白质含量基因GPC-B1的分子标记研究[J]. 天津农业科学，2014，20（9）：6-10.

[10]Joppa，LR，Cantrell R G. Chromosomal location of genes for grain protein content in wild tetraploid wheat[J]. Crop Science，1994，30（5）：1059-1064.

[11]Joppa L R，Du C，Hart G E，et al. Mapping gene（s） for grain protein in tetraploid wheat （Triticum turgidum L.） using a population of recombinant inbred chromosome lines[J]. Crop Science，1997，37（5）：1586-1589.

[12]Mesfin A，Frohberg R C，Anderson J A. RFLP markers associated with high grain protein from Triticum turgidum L.var.dicoccoides introgressed into hard red spring wheat[J]. Crop Science，1999，39（2）：508-513.

[13]Dubcovsky J，Fahima T.Positional cloning of a gene responsible for high grain protein content in tetraploid wheat[R]. BARD Final Scientific Report，2004.

[14]Avivi L. High protein content in wild tetraploid Triticum dicoccoides Korn[C]. Proceedings of the 5th International Wheat Genetics Symposium，1978：372-380.

[15]梁荣奇，张义荣，尤明山，等. 利用高分子量谷蛋白亚基的特异PCR标记辅助选育优质面包小麦[J]. 农业生物技术学报，2001，9（4）：322-325，409.张涛，韩梅，刘翠晶. 人参CYP716A53v2基因的克隆与序列分析[J]. 江苏农业科学，2016，44（6）：53-56.