杂交水稻种子纯度检测方法综述

宋丰顺++倪大虎+++倪金龙++李莉++杨剑波

摘要：建立准确、快速、经济的检测方法监控杂交水稻纯度对于保障我国水稻安全生产具有至关重要的作用。本文综述了用于杂交水稻纯度检测的各种方法，并对各种方法的优缺点进行了评述，总体来讲，我国杂交水稻纯度鉴定方法的发展趋势是由鉴定周期长向鉴定周期短，由鉴定程序复杂向简单，由成本高向成本低的方向发展。根据各种检测方法的特点，认为DNA分子标记技术和设计育种鉴定方法有较大发展空间，能满足准确、快速、经济的要求；实时荧光PCR技术具有美好的前景。

关键词：杂交水稻；种子纯度；检测；实时荧光PCR；DNA分子标计；设计育种

中图分类号： S511.03文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）06-006-05

自1976年杂交水稻在我国培育成功以来，其以明显的产量优势和广泛的生态适应性受到普遍欢迎，迅速在全国乃至世界范围推广开来[1-2]。当前杂交水稻种植面积约 1 667万hm2，约占我国水稻种植总面积的60%，累计增收稻谷逾4亿t，每年增产的粮食可多养活7 000万人[3]，为我国乃至世界的粮食安全作出了巨大贡献。杂交稻种子纯度是保障其增产的关键。杂交稻种子纯度是指杂交种子在特征特性方面典型一致的程度。由于杂交水稻制种环节多、周期长，在种子生产过程中生物学混杂和机械混杂时有发生，易导致杂交种不纯。有研究指出，在一定范围内，杂交稻纯度每下降1%，667 m2减产4～5 kg，纯度下降10%，杂交稻将失去其增产优势[4]，我国规定杂交水稻种子纯度不得低于96%。因此严格监控杂交稻种子质量，只允许合格种子进入市场和田间，对确保水稻增产具有重要意义。这其中建立准确、快速、经济的杂交种纯度检测方法对于种子质量监控具有重要意义。目前杂交种纯度检测主要有以下几种方法。

1海南种植鉴定法

利用海南冬季温光资源进行的田间种植鉴定是当前杂交稻纯度检测最常用的方法之一。海南种植鉴定结果直观且比较可靠，但种植环境条件的变化也可能引起某些假杂种与真杂种间难以区分，导致结果失真[5]。另一方面，该鉴定方法周期长，需要几个月时间，如果等待鉴定结果，再进行包装销售，将延误农民播种；如果隔年销售，将增加种子越夏的仓储费用，且储存不当会导致种子发芽率下降，将给种子公司的经营带来诸多麻烦。当前，采用海南种植鉴定的种子公司，在销售种子时，多数情况下并不知道种子真实纯度，只能凭借经验，根据天气和制种田的情况估计纯度，海南鉴定结果只作为售后参考，这给杂交水稻生产埋下了安全隐患，该行业也被称为高风险行业，流传“十年赚钱，不够一年赔”的说法。

2粒型鉴定法

粒型鉴定法通过观察种子的形态特征，与标准样品进行比较，判别种子真假，观察的主要性状有大小、形状、稃壳色、稃尖色、[JP3]稃毛长短和稀密、柱头色和夹持率等。其优点是简单、快速，但由于亲缘关系较近的种子在形态上很难区分，且同一品种内各种子形态并不完全一样，因此检验结果可靠性差[6]。

3苯酚染色法

苯酚会使不同品种的谷粒或米粒呈现不同的颜色。水稻品种的苯酚染色一直被用于籼粳亚种间种子的鉴别，通常籼稻易着色，而粳稻难着色，并表现出程度上的差异。该法对籼、粳亚种间颜色区别明显，但对亚种内的水稻区分不明显。同时，水稻种子成熟度不同，染色后颜色深浅也往往不一样，所以该方法鉴定杂交种纯度易造成人为误差或错误[7]。

4蛋白质电泳法

[JP2]由于遗传上的差异，作物不同品种间的蛋白质种类和含量不同。蛋白质电泳可将品种间的蛋白差异在凝胶上区别开来。20世纪60年代，蛋白质电泳技术即被应用到水稻等作物杂交种纯度检测。根据被检蛋白质的功能，可将其分为种子贮藏蛋白电泳和同工酶电泳两大类。目前用于纯度检测的种子贮藏蛋白主要有醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白[8-12]。同工酶是指催化反应相同而结构及理化性质不同的一组酶，它们几乎存在于所有生物中。被用于品种纯度检测的同工酶主要有酯酶同工酶、过氧化物同工酶、磷酸酶同工酶等。陆士伟等最早报道应用幼苗酯酶同工酶测定杂交水稻种子纯度[13]。李卓杰等利用胚芽的酯酶同工酶等电聚焦电泳对汕优63、博优64等进行纯度鉴定[14]。颜启传应用种子及幼苗酯酶同工酶电泳鉴定多个杂交稻品种和亲本种子[15-16]。陶芳等利用汕优64、汕优63、特优559幼芽的酯酶同工酶谱带数量和深浅进行鉴定，结果与田间鉴定相差 1%～2%[17-18]。[JP]

蛋白质电泳在纯度鉴定中存在以下不足：（1）组织特异性强，不同发育阶段和不同组织的图谱差异大；（2）结果与操作过程相关，蛋白提取液、胶浓度和电泳系统不同，结果也会不同，导致难以形成统一标准[19-20]；（3）多态性少，对于亲缘关系较近的亲本及其杂交种难以鉴定；（4）偏亲带型的出现会使结果误判[21]。所以，蛋白质电泳法未能列入我国杂交水稻种子纯度鉴定的国家标准，实践中也未得到大规模应用。

5DNA分子标记鉴定法

DNA分子标记技术的出现为杂交水稻纯度鉴定提供了新的思路。该技术直接以遗传物质DNA为基础，所揭示的多态性直接反映基因组差异。与形态学、蛋白质等其他鉴定技术相比，DNA分子标记鉴定具有明显的优点：（1）无组织特异性，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题[22-23]；（2）许多分子标记表现为共显性，特别适合杂交种的检测；（3）数量众多，几乎是无限的，遍布整个基因组；（4）多态性高，自然界存在许多等位型变异。正是因为上述优点，使得DNA分子标记技术在品种鉴定中具有广阔的应用前景。

目前，DNA标记主要有RFLP、AFLP、RAPD、SCAR、SSR等。RFLP结果稳定可靠，重复性好，是共显性标记，缺点是所需DNA量大且质量高，操作步骤繁琐，成本高。AFLP多态性丰富，所需DNA量小，但也需要酶切，对DNA纯度要求也较高，如果基因组不完全酶切会影响结果，同时，操作程序长、步骤多，电泳繁杂，且主要属于显性标记[24-25]。因此，这2项技术应用于品种鉴定的报道很少。

1996年，钱前等利用RAPD标记，成功实现对真、假Ⅱ优63种子的鉴定[26]。同年，杨剑波等应用RAPD标记在30个随机引物中筛选到6个多态引物能够区分杂交水稻汕优63及其亲本[27]。RAPD操作简单，但RAPD本身存在重大缺点：（1）结果受反应条件影响很大，在很多情况下，试验结果不能重复；（2）多态性仍不足，需要大量筛选引物获得多态标记；（3）主要为显性标记（极少数为共显性），鉴定杂交种的能力不足[28]。产生这些缺点的根源是其扩增时所用的10 bp随机引物，扩增位点不确定所致。1999年，杨剑波等将筛选到的多态性RAPD标记进行测序，并根据序列重新设计由 25～30个碱基组成的引物，将RAPD标记转化为SCAR标记，解决了RAPD标记稳定性差的问题[29]。[JP3]但是随着种子市场的发展和杂交稻品种的迅速增多，针对特定品种大量筛选引物，用单个多态标记鉴定种子的做法，显然不能满足市场需求。[JP]

SSR标记的诞生，为确定一套通用引物，鉴定多个品种提供了可能。SSR是一类由几个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，它们广泛分布于基因组的不同位置上，每个座位上基序的重复数目不同，因而形成多态性。SSR两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可用来设计特异引物，利用PCR技术扩增每个位点，通过电泳分析扩增片段的长度差异。

SSR标记由于数量丰富，在染色体上分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便等特点，而成为一种理想的杂交种检测分子标记。2000年，李莉等对协优63、协优64及其亲本进行SSR分析，筛选出13对SSR引物，可以对水稻杂交组合与亲本之间，以及杂交组合相互之间进行区分和鉴定[30]。此后，诸多的研究采用SSR标记鉴定杂交种纯度和真实性[31-38]。2006年国家标准《三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法》（GB/T 20396—2006）和2007年农业部行业标准《水稻品种鉴定DNA指纹方法》（NY/T 1433—2007）的颁布，标志着利用SSR分子标记技术鉴定杂交水稻种子纯度已经成熟，并走向真正的应用。2套标准均各自确定了一套多态性丰富、重复性好、染色体分布均匀的通用SSR标记，可用于鉴定不同的水稻品种。但是，DNA标记技术，包括SSR标记，仍需要专门的实验室，所需仪器设备较昂贵，对人员科技水平要求较高，检测过程较复杂，且成本较高，限制了该技术在基层的广泛应用。

6实时荧光PCR检测法

纯度检测一般需要检测几百个单株，上述DNA分子标记技术在检测杂交种纯度时，需要对每个单株分别检测，工作量大。实时荧光PCR技术是近年来兴起的新兴检验技术，可对群体内外源片段的含量进行检测，即只要检测1个样品。2007年，程毅等依据已报道的雄性不育特异片段R2-630WA设计了1对引物和1条TaqMan荧光探针，对17个水稻品种进行实时荧光PCR检测，结果表明：此探针能特异扩增三系杂交稻F1及不育系；纯度检测时，在测定低浓度（10%～40%）样品时偏差为2%左右，在测定高浓度（50%～100%）样品时，偏差为5%左右。其对低纯度样品的检测表现较好、高纯度样品检测结果偏差较大，分析了以下几方面原因：（1）曲线方程的推导需要更多数量和样品的重复；（2）此种绝对定量的方法受PCR体系中反应的核酸模板量影响较大，要想获得更精确的结果，最好加入含有内参基因标记的探针，实现相对定量后可大大提高检验的准确性；（3）对于实时荧光PCR这种高灵敏度的技术来说，其优点在于从所有样品中检测极少数阳性样品，因为反应中加入引物和探针的量有限，所以当样品中存在很多阳性模板时，反应容易进入平台期，检测结果则出现偏大误差[38]。实时荧光PCR技术检测杂交种纯度前景看好，但是当前的检测准确性还需进一步提高，检测标记的选择和设计方面还需进一步优化。

7设计育种鉴定法

遗传和育种家探索利用苗期标记性状设计育种，以实现杂交水稻纯度的快速、准确、经济检测。

7.1除草剂标记性状

2000年，张集文等利用辐射诱变选育出苯达松敏感致死突变体8077S，该性状由隐性单基因控制，其自交苗能被除草剂苯达松杀死，杂交种苗则对该药剂不敏感，运用该方法可在苗期快速检测和去除杂交稻中混入的两系不育系种子[39-41]。Pan等克隆了该基因（bel）[42]。黄大年等尝试用抗除草剂基因快速检测和提高杂交稻纯度[43]。

[HTK]7.2叶色标记[HT]

在两系和三系杂交稻中，给育性不稳的不育系，打上易于识别的叶色标签，是解决不育系自交结实问题的另一条有效途径。马志虎等和舒庆尧等对能产生实际应用价值的叶色标记性状进行了概括，即作为叶色标记性状必须具有以下4个主要条件[44-45]：（1）标记性状遗传稳定，不易受外界环境因素的影响；（2）标记性状明显，易目测识别；（3）标记性状未与不良性状连锁，生长健壮，对杂交种、不育系、保持系的产量无影响；（4）标记性状为隐性。根据叶片颜色的不同，可将其分为以下几类：

（1）白化转绿标记。舒庆尧等、吴伟等、杨文清、沈圣泉等、赵海军等、吴殿星等分别利用培矮64S、广占63S、Ⅱ-32B、龙特浦B种子，育成玉兔S、NHR111S、白丰A、全龙A等白化转绿型叶色标记不育系[46-54]。这些材料苗期1～3叶期表现叶缘白化，从第4叶开始转绿[55-57]。赵海军等以玉兔S为材料研究发现，白化转绿型突变体受单隐性基因控制[52]。在农艺性状方面，沈圣泉等、赵海军等的研究结果表明，这种类型的不育系无论稀播或密播，苗期生长慢于正常绿苗，但不会造成竞争致死[51-52]。Su等报道了培矮64S的白叶突变体ysa（young seedling albino），该突变体3叶期以前为白色叶，3叶期后逐渐转绿，转绿后对农艺性状无影响明显，该性状为隐性基因控制，基因已被克隆[58]。

（2）淡绿叶色标记。1999年，董凤高等选育成带有明显淡绿叶标记性状的籼型两系不育系M2S[59]。余新桥等以M2S为供体，与中红B杂交，再用其F1为母本与珍汕97B杂交，F2代选择具有明显淡绿叶标记性状的株系与珍汕97A杂交、回交选育成该类型不育系标1A[60]。宋克堡等从安农810S繁殖田中发现了1株水稻淡黄叶隐性突变体，并育成系列淡黄叶两系不育系[61]。曹立勇等将淡绿色标记性状pgl基因定位于第10条染色体[62]。杨文清等以自选的标8S为材料，遗传分析表明其黄白色性状受1对隐性主效基因控制，还与生长温度呈负相关[48]。王军等在粳稻武运粳7号中发现了1个黄绿叶自然突变体，经过多代自交形成了稳定的突变系，该突变系和武运粳7号的正反交F2代遗传分析表明，该材料的黄绿叶由1对隐性基因控制，命名为[WTBX][STBX]ygl-2[WTBZ][STBZ]，并将其定位在第6染色体RM6298标记附近[63]。田振涛等对4个淡绿叶粳稻光温敏核不育系和正常叶色粳稻不育系浙农大11S及籼型不育系培矮64S进行了开花习性的比较，结果显示：淡绿叶色不育系的开花天数、开花率、柱头外露率都低于正常叶色不育系，日开花率、颖花张开时间和张开角度易受环境条件影响，表现较大差异；但淡绿叶色不育系的开花高峰都在午前09：00或10：00，表现早花特性[64]。

（3）紫色叶标记。曹立勇等采用1份籼型紫叶水稻和两系不育系W6154S杂交，在F2代选择紫叶稻回交1次后，以系谱法逐代选择而育成了带紫叶标记的两系不育系中紫S[62]；杨腾帮等选育了明紫02S和明紫03S[65-66]；余显权等育成综合性状优良、育性转换明显的隐性紫叶两系不育系99H114紫S等[67-68]。吴关庭等通过平阳霉素与射线复合处理，从早籼品种陆青早1号中诱变获得了紫叶突变体PLM12，遗传分析认为该紫叶性状属核遗传，由1对隐性主效基因控制，同时受若干微效基因修饰[69]。同样，石帮志等将紫香稻与明恢63杂交，F1表现绿叶，F2群体绿叶株与紫叶株的分离比符合3 ∶[KG-*3]1，BC1群体的分离比符合1 ∶[KG-*3]1，证明紫香稻的紫叶性状是隐性性状[70]。但是，钱前等和曾大力等利用1份籼型紫叶水稻分别与绿叶籼、粳稻杂交，发现杂交种F1呈绿色，F2群体中绿叶与紫叶之比为13 ∶[KG-*3]3、55 ∶[KG-*3]9，符合2～3对基因的分离模式，推测绿叶稻品种均带有1对显性紫叶抑制基因IPl（t），使得杂交种F1呈绿色，另外还有2对显性基因控制紫色表型[71-72]。李维明等在其研究的F2群体中，也检测到13 ∶[KG-*3]3的分离比[73]。谢国生等对紫叶稻品种IC11003的遗传分析表明，该品种的紫叶性状受核内2对显性互补基因控制，无细胞质效应[74]。潘学彪等对W6417S的天然变异紫叶稻进行遗传分析发现，F1代植株均为绿色，F2群体绿叶株 ∶[KG-*3]紫叶株分离比有3 ∶[KG-*3]1、13 ∶[KG-*3]3和55 ∶[KG-*3]9等3种类型[75]。牟同敏等利用紫叶稻与22个不同类型的绿叶稻杂交，F1均表现为绿叶，而F2群体绿叶株：紫叶株的分离比为3 ∶[KG-*3]1、13 ∶[KG-*3]3、55 ∶[KG-*3]9、229 ∶[KG-*3]27等4种遗传分离模型[76]。这些分离比表明，紫叶水稻和绿叶亲本间存在1～4对基因的差异，其中1对为显性抑制基因，双亲之间基因数目不同，表现出不同的分离比例。邓国富用紫叶稻IRI552与22个绿叶品种杂交，F1、F2、BCF1、BCF2和F3群体的遗传分析结果表明，紫叶稻IRI552的紫叶性状由核内1对隐性紫叶基因（pl-pl）和1对显性紫叶抑制基因（Ipl-Ipl）控制，同时也受紫叶调节基因（Ci-Ci）的作用；对紫叶基因及紫叶抑制基因定位的结果表明，隐性紫叶基因（pl-pl）位于第6染色体标记RM587和RM584之间，紫叶抑制基因（Ipl-Ipl）位于第1染色体SSR标记RM9和RM488之间[77]。紫叶稻材料大多数未能在生产上大面积推广应用，究其原因要么是温敏性太强，要么是配合力、稻米品质尚不够理想等[77-81]。

7.3芽鞘紫线法

胚芽鞘是单子叶植物，特别是禾本科植物胚芽外的锥形套状物，有保护胚芽中更幼小的叶和生长锥的作用。在种子萌发时，能够看到的第一个器官便是胚芽鞘，胚芽鞘上表现的性状也是种子萌发后所能直接观察到的最早期性状。

水稻芽鞘紫线是在胚芽鞘两侧各出现的1条清晰可见的紫色线条。国内很多育种家试图将其运用于杂交种的纯度鉴定。1985年，沈又佳等发现化学杀雄制种的赣化2号杂交种芽鞘具有紫线，其母本IR24芽鞘无紫线，父本献党1号芽鞘有紫线。由于化学杀雄不彻底，杂交种中常混有母本IR24，因此他们提出通过观察芽鞘紫线鉴别杂交种中混入的母本种子[82]。富昊伟将芽鞘无紫线的三系不育系嘉浙A和中浙A与芽鞘有紫线的父本配组，杂种F1的芽鞘有紫线，据此在苗期可观察芽鞘紫线有无鉴别出杂交种中混入的不育系和保持系[83]。但这2种方法都无法将杂交种中混入的父本给区分开来，更没有能力区分串粉株和机械混杂株。

国外对于芽鞘紫线的遗传研究较早，印度学者Dhulappanavar等利用T-160（芽鞘无紫线）和AC-177（芽鞘紫线）配置的F2群体，紫线对无紫线的分离比为 195 ∶[KG-*3]61，认为该性状受2个显性重叠基因[WTBX][STBX]Pc1、Pc2[WTBZ][STBZ]和1个显性抑制基因I-Pc、1个显性反抑制基因Ai-Pc共4个基因控制[84-85]；印度的Maekeawa则认为该性状仅受2个显性互补基因[WTBX][STBX]Pc-1、Pc-2[WTBZ][STBZ]控制，与褐飞虱抗性连锁[86]。

1998年，席建民对5个杂交组合（母本均具有紫线、父本均为无紫线）进行遗传分析，F1均表现出紫线，F2紫线 ∶[KG-*3]无紫线分离比有9 ∶[KG-*3]7、15 ∶[KG-*3]1、63 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]14共4种类型，这表明紫线遗传受多对基因调控[87]。2009年，张毅等对水稻芽鞘紫线的遗传分析发现了“双亲芽鞘无紫线但其F1有紫线”的现象，该现象由[WTBX][STBX]OsAi和OsC1[WTBZ][STBZ] 2对基因控制，并将[WTBX][STBX]OsAi和OsC1[WTBZ][STBZ]分别定为在Chr.11（RM26384和C11Lz2标记间）和Chr.6（RM5754和RM19570之间，该区间的[WTBX][STBX]LOC_Os06g10350[WTBZ][STBZ]为玉米的同源色素合成基因C），同时提出了选育芽鞘无紫线而其他器官有紫色的不育系（[WTBX][STBX]Osai OsC1[WTBZ][STBZ]）和芽鞘无紫线且其他器官无紫色的恢复系（[WTBX][STBX]OsAi Osc1[WTBZ][STBZ]），实现双亲互补，配组芽鞘有紫线的杂交种，用于杂交种纯度检测的策略。与叶色法相比，该方法不仅可以区分杂交种中混有的不育系，还可以区分恢复系和无紫线种子的混杂，且芽鞘紫线在发芽后3 d就可观察到，近一步缩短了鉴定周期。但该方法与叶色法等其他方法一样，仍无法区分外来串粉和有紫线种子的机械混杂。因为绝大多数水稻都含有OsAi基因，串粉株也会表现为芽鞘紫线；且如果有芽鞘紫线种子发生混杂，在杂交种中也无法被识别出来。

8结语

建立准确、快速、经济的检测方法监控杂交水稻纯度对于保障我国水稻安全生产具有至关重要的作用。海南田间种植鉴定是最古老的鉴定方法，因为其鉴定方法简单且结果直观，仍是当前最常用的鉴定方法，但是鉴定周期太长。粒型鉴定和苯酚染色鉴定，由于准确性差，在纯度检测上已不常用，只在区别品种间差异时会使用。蛋白质电泳法在部分种子公司仍有使用，但是普及率不高。DNA分子标记技术由于其准确可靠，在种子纯度检测领域得到了大发展，随着DNA分子标记成本的降低、通量的进一步提高，DNA标记技术会有更广阔的应用。实时荧光PCR技术具有美好的前景，可以把几百份样品混合为一个样品进行检测，大大减小了检测工作量，但是准确性仍需要提升，未来很有可能有新技术在该领域有突破。设计育种鉴定具有鉴定快速、准确、成本低的特点，但需要对杂交稻的亲本进行改良，使不育系携带易识别的隐性性状，且隐性性状不能影响到农艺性状，很多报道的可用于纯度检测的不育性并没能在生产上大规模应用，可能与携带的隐性性状影响到农艺性状有关。该方法在鉴定两系杂交水稻种子过程中，因遇低温导致不育系自交结实，具有很大的应用空间。总体来讲，杂交水稻纯度鉴定方法的发展趋势是由鉴定周期长向鉴定周期短，由鉴定程序复杂向简单，由成本高向成本低的方向发展。

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