病毒组织细胞培养方法及注意事项

靳芹

摘要：细胞培养是病毒学实验研究必不可少的重要工具和手段。本文以猪乙型脑炎病毒在猪肾上皮细胞（PK-15细胞）增殖培养为例，介绍一下病毒的细胞培养方法，和一些注意事项。

关键词：细胞培养；PK-15细胞

随着畜牧业的高速发展，养殖规模的不断扩大，动物疫病也成为困扰广大养殖户的首要问题。检测出明确的疫病类型，是做好养殖业防控治疗的关键。对发病毒株的更深一步的研究，可有助于研制适于当前流行疫病的疫苗和药物制剂。这样，病毒前期的分离培养就尤为重要，因为病毒缺乏完整的酶系统，又无核糖体等细胞器，所以不能在任何无生命的培养液内生长。试验动物、鸡胚以及体外培养的组织细胞就成为人工增殖的基本工具。细胞培养与实验动物和鸡胚相比，不仅经济、方便、省时、省力，而且能提供大量生物性稳定的细胞群体，降低了外界因素的影响，使实验结果更加准确可靠。

1病毒组织细胞培养方法

1.1细胞培养所需仪器设备

干燥箱、恒温培养箱、普通冰箱、-80℃低温冰柜、高压消毒器、恒温水浴箱、普通离心机、真空泵、蔡氏滤器、显微镜、无菌室、超净工作台、细胞培养瓶、移液管（1mL、5mL、10mL）等。

1.2病毒培养过程所需溶液的配制

1.2.1营养液的配制营养液是组织细胞中赖以生长和增殖的直接环境，不仅要求含有多种营养物质，而且必须保证适宜酸碱度、温度、渗透压和气相等。以配制10mL营养液为例：需灭菌蒸馏水7.8mL、EME0.9mL、双抗（青霉素和链霉素）0.2mL、犊牛血清1mL、Na 0.1mL，调PH值7.2-7.4。

1.1.2维持液配制（以10mL为例）需灭菌蒸馏水8.3mL、MEM0.9mL、双抗（青霉素和链霉素）0.2mL、犊牛血清0.5mL、Na0.1mL调pH值7.2-7.4。

1.1.3消化液配制（以10 mL为例）灭菌蒸馏水9mL、胰酶1mL。

1.2 PK-15细胞复苏

从液氮罐中取出冻存的PK-15细胞（约1.8mL）迅速放入40℃水浴锅中（大约2min）使其溶解，然后放入离心机中1000rpm，离心5min，弃冻存液，用1mL吸管，吸培养液使细胞重新悬浮，吹打细胞，全部移入培养瓶，放37℃C02培养箱培养24h，显微镜观察结果：细胞都贴壁生长，均匀平铺在瓶壁上，形状整齐、轮廓清晰，在无菌操作台，把细胞培养瓶中的营养液倒掉，换维持液，培养24h，把原培养瓶中的维持液倒掉，把消化液分三次加入细胞培养瓶中，每次从细胞贴壁的一面开始消化（轻摇），四面都洗完，把消化液倒掉，把培养液加入培养瓶，分装成两瓶。继续按上述步骤进行细胞传代培养。

1.3猪乙型脑炎病毒接种传代好的PK-15细胞

取处理好的病毒组织，12000rpm离心10min，取上清接种于倒掉培养液的细胞培养瓶中，37℃感作1h（每隔15min慢慢摇动一次，使病毒与细胞充分作用）；同时做空白对照。1h后，把接毒瓶与对照瓶同时加维持液（维持液调pH7.6），放37℃温箱，解毒12h后，接毒细胞无明显变化，相对于对照细胞，维持液稍黄，16h后，维持液开始变浑浊，接毒20h后细胞有了明显变化，细胞界限模糊不清晰，细胞的生长受到抑制，有些细胞有融合现象，已有两个或三个细胞融合为一个细胞（这时，要在接毒细胞和对照细胞中均加入2mL NaHC03，调环境PH7.5-7.7，要使维持液保持一定的PH环境），接毒24h后，接毒细胞形状变细长，36h后90%细胞已经圆缩，开始收毒，收的乙脑细胞毒放-80℃低温冰柜冻36h，然后拿出冻融一次（-80℃病毒放4℃冰箱2min，然后融化再放入-80℃冰柜），3h后，取出病毒按上步骤融化分装，为第一代病毒。取第一代病毒接种细胞，按以上操作步骤进行传代。传代到十代以上，可以保存病毒作为下一步试验用毒。

2病毒组织细胞培养注意事项

1）培养液配制时，采用的动物血清是细胞生长所必须的营养物质，有很强的酸碱缓冲作用和促进细胞贴壁的作用。一般采用犊牛血清，但不是所有病毒都通用一种血清，比如犊牛血清就抑制细小病毒的生长，要改为5月龄以内的胎牛血清。所以，根据所增殖病毒的不同，加入其适宜的血清。营养液的PH值，细胞最适生长的PH范围是7.0-7.4，细胞通常可耐受PH6.6-7.8较大范围的变化，偏酸或偏碱的环境持续时间不宜超过24h，否则细胞很快老化。较碱的生长液更适于细胞贴壁，但培养时的PH应保持在7.2-7.4之间。

2）培养细胞所用培养瓶，移液管等玻璃器皿洁净与否，对于细胞培养十分重要。必须经清水冲洗，再于1%优质洗衣粉的水溶液内蒸煮30min，随后刷洗，并用清水和蒸馏水分别冲洗5～6次以上，烘干。然后经包扎于160-170℃干燥灭菌2h，取出备用。

3）细胞培养和接毒后培养的内外环境一定要保持无菌，工作前后要紫外灯半小时杀菌，尤其是环境中不要感染支原体，否则，细胞培养将无法继续。

4）一般细胞培养到5代以后，可以进行接毒。病毒传代到13代以后基本稳定，可以作为下一步试验用毒。一般在接毒培养瓶内约有2/3的细胞发生折光性增强、凝缩不整及细胞核变形、破碎、脱落时，应立即收获。在实际工作中，往往因病料中病毒含量少或病毒起初不适应在细胞内增殖，初代分离病变不明显，但通过盲传而逐步增强，从而达到分离病毒的目的。

5）不同的病毒，会有自己所敏感的增殖细胞。因此，实际工作中，我们要根据自己所研究的病毒，选择适宜的培养细胞。病毒传到多少代可以达到稳定状态，不同的病毒也会不同，要根据具体试验结果而定。