细胞密度对猪圆环病毒增殖与检测准确度的影响

邱贞娜，朱秀同，梁武*，李晓艳，郁宏伟，刘涛，赵玉龙，刘超

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司河北保定071000；2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定071000）



细胞密度对猪圆环病毒增殖与检测准确度的影响

邱贞娜1，2，朱秀同1，2，梁武1，2*，李晓艳1，2，郁宏伟1，2，刘涛1，2，赵玉龙1，2，刘超1，2

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司河北保定071000；2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定071000）

摘要：为了提高猪圆环病毒毒液生产批次间滴度的稳定性，提高培养毒液病毒滴度检验和成品疫苗效力检验的准确度，本实验对PK15细胞接种密度进行了研究。结果显示：病毒培养阶段，细胞最佳接种密度为2～2.5×105/mL，毒液滴度和疫苗效力检验时，最佳细胞接种密度为1.5～2×105/mL。

关键词：猪圆环病毒；细胞密度；病毒滴度；疫苗效力检验

猪圆环病毒是 （Porcine circovirus type 2，PCV2）一种圆形小颗粒病毒，粒子直径为17 nm，呈20面体对称，无囊膜，CsCl浮力密度为1.37 g/cm3，是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征的病原。PCV2感染可导致动物机体免疫系统功能严重受损，形成免疫抑制，增强对其它多种病原体的易感性，引起在正常情况下具有较低致病性的病原体感染发病，使猪群发生难以控制的复发性疾病和多重感染［1］。该病呈世界流行，我国的大型猪场普遍存在该病，给养猪业造成了相当大的经济损失，疫苗免疫是控制PCV2感染引起相关疾病的重要手段。

PK15细胞是PCV2敏感细胞系，被广泛用于疫苗生产。本实验就培养和检验PCV2的PK15细胞密度参数进行了研究，以期找到最佳病毒培养细胞密度，保证疫苗生产中培养毒液批次间滴度的稳定性，提高病毒滴度检验和疫苗效力检验的准确度。

1材料和方法

1.1主要试剂和生物材料

猪肾传代细胞系（PK15细胞）和猪圆环病毒2型（ZJ/C株）由公司种毒室保存和提供；新生牛血清、MEM干粉培养基购自gibco公司；PCV2-cap单克隆抗体购自浙江同点生物技术有限公司；羊抗鼠二抗购自KPL公司。

1.2猪圆环病毒培养

长成良好单层的PK15细胞，采用EDTA-胰酶消化，经吹打分散均匀，细胞计数后，接种培养瓶，同时加入猪圆环病毒，37℃培养72～96 h收获，将培养瓶反复冻融3次，取样后冷冻保存。

1.3病毒滴度检验

将病毒液用MEM液10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7三个滴度接种96孔板，0.1 mL/孔，每滴度6孔，同时接种分散均匀的PK15细胞，0.1 mL/孔，置37℃培养72 h，冷丙酮固定，采用IFA法检验，统计病毒感染孔数，按照Reed-Muench法计算半数细胞感染量（TCID50/mL）。

1.4疫苗效力检验

按照《猪圆环病毒2型灭活疫苗（ZJ/C株）制造及检验试行规程》进行灭活疫苗制备和效力检验。效力检验采用小鼠攻毒法，将疫苗免疫健康Balb/c小鼠，并同空白对照鼠进行攻毒，将免疫组和空白对照组小鼠脾研磨后，在PK15细胞上进行培养，用IFA法检测PCV2抗原，出现绿色荧光即为阳性。空白对照小鼠应至少7/10为病毒分离阳性，免疫小鼠应至少7/10为病毒分离阴性。

2结果

2.1细胞密度对PCV2培养滴度的影响

分散均匀的PK15细胞，分别以每毫升细胞数量为1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、4×105的细胞密度接种培养瓶，进行病毒培养，并重复接毒培养4个批次，收获的病毒液的病毒滴度（见表1）。

表1 不同细胞密度收获毒液病毒滴度

试验结果表明，细胞最佳接种密度为2～2.5× 105/mL时，单批次病毒液滴度最高，批次间滴度水平最稳定。而细胞密度为1.5×105/mL和4×105/mL时，病毒滴度明显下降，而细胞密度为3×105/mL时，批次差异增大。

2.2细胞密度对病毒滴度检验的影响

同一病毒液样品分别以每毫升PK15细胞数量为1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、4×105的细胞密度进行病毒滴度测定，并且重复3次。检验结果（见表2）。

表2 不同细胞密度的检验结果

试验结果表明，细胞密度为1.5～2×105/mL时，测定效价最高，批次间浮动最小。

2.3细胞密度对病毒分离率的影响

空白对照组鼠脾，分别用每毫升PK15细胞数量为1.5×105、2×105、3×105的细胞密度进行测定，并重复检测三个批次的空白对照组鼠脾。测定结果（见表3）。

表3 不同细胞密度的病毒分离比率

由结果可得，细胞密度控制在1.5～2×105/mL时，阳性对照鼠脾的分离率高，细胞密度达到3× 105/mL时，病毒分离率明显下降。

3讨论

实验结果显示，在病毒培养阶段，细胞最佳接种密度为2～2.5×105/mL，细胞密度过低或过高，收获毒液的病毒滴度均会下降；病毒滴度和成品疫苗效力检验时，最佳细胞接种密度为1.5～2×105/mL，在这个细胞密度下，测定值最高，批次间最稳定。PCV2在体外培养时，并不会造成培养细胞的病变，病毒复制过程中，依赖宿主细胞的聚合酶，这种酶类主要是在细胞繁殖的S周期中合成［2，3］，所以猪圆环病毒适合在增殖旺盛的细胞上增殖，而不同的细胞接种密度，会影响细胞生长，尤其是细胞培养一定时间后，随着细胞密度的增加，会出现密度抑制现象，影响细胞的分裂增殖，从而影响病毒的复制。在猪圆环病毒生产和检验中精确控制细胞接种密度，可保证生产批次间滴度的稳定性，提高病毒滴度和成品效力检验的准确度。（编辑：赵晓松）

参考文献

［1］宣长和，马春全，陈志宝［M］.3版.北京：中国农业出版社，2010：172-180.

［2］刘长明，张超范，危艳武，等.猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定［J］.中国兽医预防学报，2006，（3）：248-252.

［3］严伟东，李文浩，李文涛等.猪圆环病毒2型WH株的优化培养［J］.中国畜牧兽医学会2010学术年会论文集，2010：1184-1188.

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.6.044

基金项目：国家农业科技成果转化资金项目（2014GB2A200324）

作者简介：邱贞娜（1982-），女，河北保定人，助理兽医师，主要从事兽医生物制品方面研究，E-mail：qzn8082@163.com。

*通信作者：梁武（1968-），男，天津人，博士，高级兽医师，主要从事兽医生物制品方面研究，E-mail：sales@ringpu.com。

The Effect of Cell Density on Porcine Circovirus Proliferation and Detection Accuracy

Zhen Naqiu1，2，Xiu Tongzhu1，2，Liang Wu1，2*，Xiao Yanli1，2，Hong Weiyu1，2，Liu Tao1，2，Yu Longzhao1，2，Liu Chao1，2
（1.Ringpu（Baoding）Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Baoding，Hebei，071000；2.Engineering and Technology Research Center of Veterinary Biological Products，Baoding，Hebei，071000）

Abstract：In order to improve the stability of the batch of porcine cirovirus proliferation，and improve the testing accuracy for virus titer or vaccine efficacy，we studied the density of the PK15 cell inoculation.The results show that，the optimal cell inoculation density is 2～2.5 x 105/mL in the virus culture stage，while the best cell inoculation density is 1.5～2 x 105/mL in the stage of the testing for virus titer or vaccine efficacy.

Keywords：Porcine circovirus virus；Cell density；Virus titer；Vaccine efficacy test