臭牡丹总黄酮介导Wnt/β-catenin信号转导诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡

胡　琦　谭小宁　余　娜　朱　沛　陈思勤　朱克俭

(湖南省中医药研究院附属医院，长沙，410006)



臭牡丹总黄酮介导Wnt/β-catenin信号转导诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡

胡琦谭小宁余娜朱沛陈思勤朱克俭

(湖南省中医药研究院附属医院，长沙，410006)

摘要目的：探讨臭牡丹总黄酮诱导肝癌细胞凋亡的作用及机制。方法：体外培养HepG2细胞，流式细胞术检测臭牡丹总黄酮对细胞凋亡的影响；RT-PCR法检测臭牡丹总黄酮作用于HepG2细胞48 h后对β-catenin、Tcf-4、CD44v6 mRNA表达的影响。结果：流式细胞术结果显示：随着臭牡丹总黄酮剂量的增加，细胞凋亡比例亦相应增加。PT-PCR结果显示不同剂量臭牡丹总黄酮作用下β-catenin、Tcf-4、CD44v6 mRNA的表达均降低，与对照组相比具有统计学意义。结论：臭牡丹总黄酮诱导HepG2凋亡，能下调β-catenin、Tcf-4、CD44v6基因的表达，其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路并抑制其关键基因有关。

关键词臭牡丹总黄酮；肝癌；Wnt/β-catenin信号通路；凋亡

肝癌是我国仅次于肺癌的第2大癌症杀手。近年来中医药在我国的肝癌防治研究方面发挥着越来越重要且独特的作用。臭牡丹是根据著名中医药学家欧阳锜研究员，发掘湖南民间治疗恶性肿瘤单方，通过多年的反复临床、科研实践筛选出来并习用的一味中草药。其性平，味辛、苦，具有健脾养血、解毒散瘀之效。前期研究表明，臭牡丹具有镇痛、催眠、抑菌、抗炎及抗肿瘤的药理作用[1]。其茎叶含有大量黄酮成分，目前分离出来的黄酮类化合物有明显抗肿瘤活性[2-3]，但其抗肿瘤机制相关研究颇少。Wnt/β-catenin信号通路作为细胞信号转导系统之一，参与肿瘤发生发展的机制涉及细胞凋亡等多方面。本研究选择人肝癌细胞HepG2细胞株为实验对象，观察臭牡丹总黄酮对HepG2细胞凋亡以及对Wnt/β-catenin信号传导通路的影响，以从一定角度探讨臭牡丹总黄酮抗肝癌的具体机制。

1材料

1.1药物臭牡丹饮片湖南省中医药研究院附属医院中药房提供，经湖南省中医药研究院中药研究所鉴定、提取。提取采用溶剂萃取法，取臭牡丹地上部分，加入10倍量蒸馏水煮沸20 min后过滤，剩余残渣再用蒸馏水加热提取，将两次滤过液合并，浓缩后用3倍量95%乙醇静置48 h后，减压过滤并回收滤液中乙醇至无醇味。溶液依次使用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯提取液浓缩、干燥。干膏粉黄酮总含量65%，1 g相当于生药30 g。

1.2试剂DMEM培养基(美国Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Amresco公司)；胎牛血清(上海博谷生物科技有限公司)；MTT(德国biomol公司)；二甲基亚砜(德国biomol公司产品)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物)；逆转录试剂盒(Fermentas)；Trizol(Invitrogen)。

1.3细胞人肝癌细胞株HepG2，由中南大学细胞中心提供，于湖南省中医药研究院附属医院中心实验室传代培养。

1.4设备超净工作台(上海净化设备厂)；二氧化碳孵箱(德国Heraeus公司)；22R型低温高速离心机(知信仪器)；流式细胞仪(美国BD公司)；荧光定量PCR仪(Roche 480)。

2方法

2.1人肝癌细胞株HepG2的体外培养HepG2在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃，5% CO2条件下恒温恒湿培养箱中培养。根据细胞生长情况，细胞汇合率达70%～80%，待细胞生长达饱和状态时，进行消化传代，选择对数生长期细胞进行实验。

2.2药物配制准确称取50 mg臭牡丹总黄酮，溶于2 mL二甲基亚砜(DMSO)溶液中，滤器过滤，得储液为25 mg/mL。用完全培养基稀释成工作浓度：10 μg/mL，25 μg/mL，40 μg/mL。

2.3流式细胞术检测臭牡丹总黄酮对HepG2细胞凋亡作用的影响实验分为空白组，臭牡丹总黄酮低剂量组(10 μg/mL)、臭牡丹总黄酮中剂量组(25 μg/mL)、臭牡丹总黄酮高剂量组(40 μg/mL)，用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗涤细胞2次，每次2 000 r/min离心5 min，收集约1～5×105细胞，加入500 μL的Binding buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀，室温、避光，反应5～15 min，在1 h内用流式细胞仪观察检测细胞凋亡情况。

2.4荧光定量PCR检测臭牡丹总黄酮对Wnt/β-catenin通路中关键因子β-catenin,Tcf-4,CD44v6基因表达的影响将空白组、低剂量组(10 μg/mL)、高剂量组(40 μg/mL)细胞收集，Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定提取的总RNA浓度，以组织总mRNA为模板，逆转录成cDNA，逆转录反应体系20 μL(0.2 mL无酶PCR tube管)：1 μL RNA，1 μL Random primer，10 μL无菌DEPC处理水，70 ℃加热5 min，迅速插入冰中冷却。再依次加入：4 μL 5×Reaction buffer、2 μL dNTP、1 μL RNase inhibitor、37 ℃加热5 min。再加入：1 μL M-MLV逆转录酶(200units)，42 ℃，1.5 h；72 ℃反应10 min。所得cDNA于-20 ℃冻存。

SYBR法检测基因表达，实时定量PCR(每个样本每个指标3个孔，共30 μL体系，每孔10 μL)体系组成：1 μL cDNA，0.5 μL Primer A(10uM)，0.5 μL Primer B(10uM)，15 μL 2X SYBGREEN PCR Master Mix，13 μL PCR H2O。反应条件：95 ℃10 min，95 ℃ 10 s，59 ℃50 s，读板，共40个循环。引物序列见下表1。

表1　引物序列

2.5统计学处理采用SPSS 19.0统计软件。计量样本采用t检验比较，不符合正态分布的样本采用秩和检验；计数样本采用秩和检验，构成比之间比较用χ2检验，检验水平P<0.05。

3结果

3.1臭牡丹总黄酮对HepG2凋亡的影响流式细胞仪观察结果显示用不同浓度臭牡丹总黄酮干预后，细胞凋亡比例发生相应变化，低、中、高剂量组的凋亡比例分别为：(16.33±4.73)%、(21.36±8.44)%、(15.42±13.48)%，其中中剂量臭牡丹总黄酮干预后凋亡比例最大，与正常对照组(5.84±2.33)%比较有统计学意义(P<0.01)，提示臭牡丹总黄酮可以促进HepG2细胞凋亡(见图1，图2)。

3.2臭牡丹总黄酮对β-catenin、Tcf-4、CD44v6基因表达的影响β-catenin、Tcf-4、CD44v6及actin的实时荧光扩增曲线图提示扩增曲线基本拟合较好，表明各组PCR反应体系稳定可靠；β-catenin、Tcf-4、CD44v6及actin的实时荧光溶解曲线图均有单一主峰，且重复多次所得到的溶解温度均值上下不超过1 ℃，表明扩增产物具有特异性。

各组HepG2细胞β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA表达量，分析显示总的组间差异有统计学意义(P<0.05)。进一步两两比较发现：与空白组比较，臭牡丹总黄酮高剂量组β-catenin、Tcf-4 mRNA的表达水平明显下调(P<0.01)，低剂量组β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA的表达水平轻度下调(P<0.05)。提示臭牡丹总黄酮可降低β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA的表达水平(见图3)。

图1　流式细胞术检测HepG2凋亡图

图2　不同剂量臭牡丹总黄酮对HepG2细胞凋亡率的影响

图3　不同质量浓度的臭牡丹总黄酮对HepG2细胞β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA的表达mRNA表达的影响

4讨论

自1963年美国化学家瓦尼(M.C.Wani)和沃尔(Monre E.Wall)首次从太平洋杉(Pacific Yew)的树皮和木材中分离到的紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有较高活性开始，随着现代医学对肿瘤治疗理念的深入与改变，植物有效成分等天然药物提取物越来越受到肿瘤学家与药理学家的重视。

国内外相关研究证实，臭牡丹具有良好抗肿瘤活性，且其不良反应小，因此具有良好应用前景。其茎叶含有大量黄酮成分，臭牡丹目前分离出来的黄酮类化合物具有明显抗肿瘤活性。黄酮类发挥抗肿瘤作用主要通过以下途径：对细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKS)产生抑制、对蛋白质磷酸化和去磷酸化过程进行调节、逆转肿瘤细胞多药耐药、诱导细胞凋亡等[4-5]。

细胞凋亡是一种细胞主动性死亡模式，在肿瘤的形成和演变过程中起着重要的作用[6]。Wnt/β-catenin信号传导途径作为与肿瘤密切相关的经典通路，与人类多种癌症的发病过程都密切相关。肝细胞癌的产生、发展与Wnt/β-catenin信号通路关系密切。Wnt/β-catenin信号通路影响细胞行为的作用主要和调节TCF家族的DNA结合蛋白转录性质有关，胞质内β-catenin表达稳定是其核心。β-catenin作为通路中的关键因子，一方面其表达程度与肝癌的发生发展及转移呈正相关，另一方面其可以激活下游转录因子4(Tcf-4)[7]基因和靶基因之一的CD44v6基因[8]调节细胞凋亡、细胞周期以及细胞黏附等肿瘤发生的多种机制。

本研究通过流式细胞检测得出的臭牡丹总黄酮处理HepG2细胞后细胞凋亡率明显增加。不同浓度臭牡丹总黄酮分别干预HepG2细胞48 h后，发现随药物浓度的增加，β-catenin、Tcf-4、CD44v6表达下降程度越高，说明臭牡丹总黄酮可以抑制β-catenin的表达，进而抑制相关因子Tcf-4和CD44v6转录而发挥其抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，表明臭牡丹总黄酮抗肝癌HepG2的机制可能与阻碍Wnt/β-catenin信号通路有关。

参考文献

[1]马玲，彭丽花.中药臭牡丹与气道高反应[J].现代中西医结合杂志，2009，18(26):3264-3266.

[2]常徽.植物黄酮抗肿瘤研究进展[J].国外医学，2006，33(5):296-300.

[3]杨博，李志裕，尤启冬.黄酮类化合物的抗肿瘤作用机制研究进展[J].药学进展，2008，32(9):391-397.

[4]Motoo Y，Sawabu N.Antitumor effects of saikosaponins，baicalin and baicalein on human hepatoma cell lines[J].Cancer Lett，1994，86(1):91-95.

[5]绳娟，杨振，姜红柳，等.黄芩总黄酮对S180、Hep-A-22和Bcap-37肿瘤细胞的抑制作用[J].吉林大学学报，2008，34(3):401-404.

[6]Lin L，Wang P，Zhao XL.Study on curcumin-induced apoptosis in ovarian cancer resistant cell lines COC1/DDP[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2012，43(3)：335-339.

[7]Zhang CY，Zhang L，Yu HX，et a1.Curcumin inhibits the metastasis of K1 papillary thyroid cancer cells via modμLating E-cadherin and matrix metalloproteinase-9 expression[J].Biotechnol Lett，2013 Mar 9.[Epub ahead of print].

[8]Sun H1，He S，Wen B，ea tl.Effect of Biejiajian Pills on Wnt signal pathway molecules β-catenin and GSK-3β and the target genes CD44v6 and VEGF in hepatocellular carcinoma cells[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2014，34(10):1454-1458.

(2016-05-25收稿责任编辑：洪志强)

Research on the Medicate Effect of Clerodendron Bungei Flavornoids on Wnt/β-catenin in Inducing the Apoptosis of HepG2

Hu Qi,Tan Xiaoning,Yu Na,Zhu Pei,Chen Siqin,Zhu Kejian

(AffiliatedHospitalofHuNanAcademyofTraditionalChineseMedicine,Changsha410006,China)

AbstractObjective:To discuss the apoptotic effect of Clerodendron bungei flavornoids on liver tumor cells and the possible mechanism.Methods:To culture HepG2 cells in virto,and investigate the apototic effect of clerodendron bungei flavornoidson by flow cytometry.The mRNA expression levels of proteins β-catenin,Tcf-4 and CD44v6 of HepG2 tumor cells were detected by RT-PCR after 48h treatment of flavornoids.Results:Flow cytometry indicates that along with the rising dose of Clerodendron bungei flavornoids,the apoptosis rate of HepG2 cancer cells begin to grow.After 48h treatment of flavornoids,the mRNA expression levels of proteins β-catenin,Tcf-4 and CD44v6 of HepG2 tumor cells were down-regulated significantly,and compared with the control group,significant difference exist.Conclusion:Clerodendron bungei flavornoids can induce the apoptosis of HepG2 tumor cells and decrease the mRNA expression levels of proteins β-catenin,Tcf-4 and CD44v6.This might relate to its regulating effect on Wnt/β-catenin pathway and inhibit the key gene's expression.

Key WordsClerodendron bungei flavornoids; Liver cancer; Wnt/β-catenin pathway; Apoptosis

基金项目：国家自然科学基金项目(编号：81503452)

通信作者：谭小宁(1987—)，女，助理研究员，研究方向：中药抗肿瘤成分及其作用机制；朱克俭(1955.12—)，男,研究员,研究方向:内科疑难病证辨治方法,E-mail:0731zkjo@263.net

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.004