臭牡丹总黄酮抑制小鼠Lewis肺癌实体瘤及其与p53、bcl-2、bax表达相关性研究

陈思勤　朱克俭　李勇敏　周　坚

(湖南省中医药研究院附属医院，长沙，410006)



臭牡丹总黄酮抑制小鼠Lewis肺癌实体瘤及其与p53、bcl-2、bax表达相关性研究

陈思勤朱克俭李勇敏周坚

(湖南省中医药研究院附属医院，长沙，410006)

摘要目的：探讨臭牡丹总黄酮对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其与p53、bcl-2、bax基因表达的相关性。方法：取近交系雄性C57BL/6小鼠50只，造模，将造模成功的Lewis肺癌小鼠40只随机分成模型组,顺铂组,臭牡丹总黄酮高、低剂量组；另取10只无瘤小鼠作为空白对照组。腹腔注射给药,模型组给予生理盐水0.01 mL/g,连续14 d；顺铂组给予顺铂0.4 mg/kg连续5 d；臭牡丹高、低剂量组分别予臭牡丹总黄酮提取物0.6 g/kg、0.3 g/(kg·d)，连续14 d。给药结束后次日处死小鼠,称取瘤重，计算肿瘤抑制率，采用Real-time PCR法检测p53、bcl-2及bax mRNA的表达水平。结果：1)对瘤重影响：4组瘤重结果如下±s)：模型组(4.70+1.29)g、顺铂组(2.24+0.68)g、总黄酮高剂量组(3.26±1.06)g、总黄酮低剂量组(3.99±1.31)g；其中顺铂组、总黄酮高剂量组瘤重低于模型组(P<0.05),并且该2组瘤重无统计学意义(P>0.05)。2)肿瘤抑制率：顺铂组：53.4%；臭牡丹总黄酮高剂量组：30.6%,臭牡丹总黄酮低剂量组：15.1%。3)对基因表达影响：臭牡丹总黄酮高、低剂量组皆能上调p53和bax mRNA表达(高剂量组P<0.01,低剂量组P<0.05)；顺铂组能下调bcl-2(P<0.05)及上调bax mRNA表达(P<0.01)。结论：臭牡丹总黄酮能够改善Lewis肺癌小鼠生存状况,能有效抑制肿瘤生长；并且其抑制肿瘤生长的分子机制可能与上调p53和bax mRNA的表达以诱导肿瘤细胞凋亡有关。

关键词臭牡丹；黄酮；Lewis肺癌；Real-Time PCR

臭牡丹(Clerodendrum Bungei Steud)性平，味辛、苦，功能祛风除湿、解毒散瘀[1]。作为治疗肿瘤的常用中药，临床多年来广泛用于多种肿瘤尤其是肺部肿瘤的治疗，取得了较好的临床疗效[2～5]，为此，笔者采用动物实验对其总黄酮提取物抗实体瘤作用进行了初步研究，结果报道如下。

1材料

1.1细胞株及动物Lewis肺癌细胞株；近交系C57BL/6雄性小鼠60只，体重(18±2)g，4周周龄。

1.2主要试剂及药物TRIZOL试剂：Invitrogen；SYBR Green qPCR Mix：TOYOBO；DEPC：Amresco；反转录试剂盒：美国Fermentans公司；三氯甲烷：上海化学试剂公司；异丙醇：上海化学试剂公司；无水乙醇：上海化学试剂公司；顺铂：规格：10 mg，山东齐鲁制药，批文号：国药准字H20023460，批号：1110381DB。

臭牡丹总黄酮：由湖南省中医药研究院附属医院中药房提供臭牡丹生药，经湖南省中医药研究院中药研究所提取，总黄酮含量65%，1 g相当于生药30 g，批号：20130720。

2实验方法

2.1Lewis肺癌模型建立将细胞浓度已调整至1×107/mL的Lewis肺癌细胞悬液摇匀，接种至5只C57BL/6小鼠右侧腋下皮下，每只0.2 mL。14 d待肿瘤充分生长后(约2.5cm×2.5cm大小)处死小鼠，在超净工作台上完整剥离右侧腋下瘤体，放置于培养皿内，用无菌生理盐水冲洗2遍后用PBS液冲洗2遍，取生长较好的鱼肉样组织约4 g，放入200目过滤筛中，加少量PBS液，充分研磨3遍，将细胞悬液浓度调整至1×107/mL，使用台盼蓝染色观察，用细胞计数板记录活细胞数量(活细胞数量须大于95%)，并迅速接种至50只C57BL/6小鼠右侧腋下皮下，每只0.2 mL，造模过程要求在1 h之内完成。

2.2分组及给药接种肿瘤7 d后，观察并选择接种肿瘤成功小鼠40只，随机分为模型组，顺铂阳性对照组，臭牡丹高剂量组和臭牡丹低剂量组4组，每组10只，另取正常小鼠10只作为空白对照组。分组后开始腹腔注射给药，给药剂量根据人体表面积折合法计算。模型组：生理盐水0.01 mL/g，连续14 d；顺铂组：顺铂0.4 mg/kg连续5 d；臭牡丹高剂量组：总黄酮提取物0.6 g/kg(相当于成人1日口服量30 g臭牡丹生药的5倍剂量，用生理盐水稀释)，连续14 d；臭牡丹低剂量组：总黄酮提取物0.6 g/kg(相当于成人1日口服剂量30 g臭牡丹生药的2倍剂量，用生理盐水稀释)，连续14 d。

2.3观察指标与检测

2.3.1肿瘤抑制率给药完毕24 h后处死小鼠，在无菌操作下，完整剥离肿瘤瘤体，称取瘤重，肿瘤生长抑制率(IR)=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。

2.3.2Real-time PCR法检测肿瘤bcl-2、bax和p53 mRNA的表达RNA提取：取生长良好的肿瘤组织100 mg入1 mL Trizol试剂，将组织置于冰上充分匀浆，细胞用移液枪轻轻吹打；将匀浆组织标本加入EP管中，剧烈震荡30 s，静置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分混匀，室温静置5 min；离心：4 ℃，12 000 r/min，15 min；吸去上清液，转入新的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀，放置于4 ℃冰箱10 min；离心：4 ℃，12 000 r/min，10 min；去上清液，留取沉淀，加入1 mL 75%乙醇(预冷)，震荡洗涤RNA沉淀；离心：7 500 r/min，5 min；尽量吸去上清液，空气干燥10 min；加入20 μL的DEPC水溶解。

检测RNA的完整性：1.5%琼脂糖电泳：将琼脂糖0.45 g+0.5×TBE 30 mL，用微波炉中火沸腾2次，防止挥发，融化的琼脂糖常温冷却至60 ℃时加入10 mg/mL溴化乙锭(EB)1.5 μL(含量为0.5 μg/mL)，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30～45 min；电泳槽中加入足量的0.5×TBE，垂直拔除梳子，琼脂糖凝胶放入电泳槽中，液面浸过胶1～2 mm，点样，取3 μL RNA，1 μL 6×溴酚蓝buffer在透明胶上混匀点样，开启电源，电压为100V，电泳时间15 min，后置于凝胶图像成像分析仪下扫描，若可见28 s，18 s条带，表示RNA完整。

消化RNA中的DNA：总体积100 μL(RNA 17 μL、DNase 3 μL、Rnase inhibitor 3 μL、10×PCR Buffer 10 μL、25 mmol/L MgCl233 μL)，步骤如下：37 ℃水浴1 h；加等体积苯酚50 μL和氯仿50 μL抽提一次；4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；取上清液，置于小EP管中，加200 μL异丙醇，充分混匀，放置10 min；4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；弃上清液，加75%乙醇0.5 mL，充分溶解；4 ℃，7 500 r/min，离心5 min，弃乙醇，室温干燥10 min，加入20 μL DEPC水，冰上放置30 min，-20 ℃保存。

逆转录反应(cDNA合成)：将1 μL Oligo dT(0.5 μg/μL)和5.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC处理水至12 μL；混匀后离心，65 ℃温浴5 min，立即置于冰上；比例设置：5×Reaction Buffer 1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、Antisense 1 μL、10 mM dNTPs 10 μL、Reverse Transcriptase 7 μL、Total volume 20 μL(在42 ℃反应1 h，后在70 ℃水浴锅中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活)混匀，短暂离心；cDNA置于-20 ℃保存备用。

Real-Time PCR扩增：引物合成与设计：参照GenBank上的bax、bcl-2、p53及GAPHD基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物，并在GenBank上进行BLAST比对检测其特异性。如表1。

表1　引物设计表

反应体系：cDNA 1 μL、Sense 1 μL、Antisense 1 μL、2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL、H2O 7 μL、Total 20 μL。

反应条件：95 ℃，3 min一个循环，(95 ℃ 15s，62 ℃(p53)、60 ℃(bcl-2)、56 ℃(bax)30 s，PCR仪采集荧光信号)40个循环。

数据分析：采用2-△△Ct法对Real-Time PCR结果进行数据分析：△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因；△△Ct=△Ct给药组-△Ct对照组；差别倍数=2-△△Ct，其中模型组的数值均为1；2-△△Ct数值若大于1则说明该目的基因较模型组上调，若小于1则说明该目的基因较模型组下调。

3结果

3.1臭牡丹总黄酮对Lewis肺癌实体瘤小鼠肿瘤生长抑制作用顺铂组、臭牡丹总黄酮高剂量组瘤体重量均低于模型组(P<0.05)，其中顺铂组较模型组瘤重差异最为明显(P<0.01)；臭牡丹低剂量瘤重较模型组稍低，但P>0.05；多重比较中臭牡丹总黄酮高剂量瘤重组较顺铂组无统计学意义(P=0.259)，提示两药抑制肿瘤效果近似，臭牡丹总黄酮对Lewis肺癌移植瘤具有明显抑制作用，其中高剂量组抑瘤率为30.6%。见表2。

3.2臭牡丹总黄酮对Lewis肺癌小鼠p53、bcl-2和bax mRNA表达的影响如表3所示，相较模型组，臭牡丹总黄酮高剂量组p53、bax mRNA的表达水平显著上调，并且低剂量组p53、bax mRNA的表达水平明显上调，而这2组的bcl-2 mRNA表达水平有下调趋势，但P>0.05；顺铂组bax mRNA的表达水平显著下调，bcl-2 mRNA表达水平也明显下调，但p53 mRNA的表达水平下调趋势不明显。

表2　各组Lewis肺癌实体瘤小鼠瘤重及肿瘤抑制率±s)

注：与模型组相比：*P<0.01，**P<0.05。

表3　各组Lewis肺癌小鼠p53、bcl-2、bax mRNA含量

注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01。

4讨论

原发性支气管肺癌(肺癌)，是目前恶性肿瘤肿瘤死亡的主要原因。其中，非小细胞肺癌占肺癌总人数的75%～80%。2010年美国的肺癌新发病例估计有222 500例，因肺癌死亡的有157 300例[6]。中医药治疗是目前中晚期非小细胞肺癌患者的主要方法之一。与化疗相比，中医药治疗对实体瘤的疗效不及化疗，但在症状改善和中位生存期方面较化疗有明显优势[7]。

细胞凋亡是一种细胞内在的程序性自杀机制，导致细胞可控制的崩解为凋亡小体，后被周围细胞和吞噬细胞识别并且吞噬。细胞凋亡失调、细胞凋亡机制出现异常，则细胞无限增殖化而无法坏死凋亡，导致肿瘤的形成。并且放化疗及生物治疗等亦能通过诱导细胞凋亡以达到治疗肿瘤的目的[8]。细胞凋亡相关基因包括：Fas受体与Fas配体、Caspase家族、Apaf-1、bcl-2家族、p53等。bcl-2基因是1985年Tsujimoto等从大多数滤泡型非霍奇金B淋巴细胞瘤中发现的原癌基因，1988年Vaux证实bcl-2基因高表达可明显维持细胞存活，而不影响细胞增殖。其高表达会抑制放、化疗诱导的凋亡；抑制其表达则可能增加放、化疗敏感性[9-10]。bax基因是1993年Oltvai等从表达bcl-2的人B细胞系RLT中分离出的蛋白质分子，有研究表明[11-12]bax基因表达下调或缺失可导致肿瘤发生，并与肿瘤放化疗疗效不好相关。p53基因是定位于17号染色体短臂(17p13.1)，编码分子量53kd的和磷酸蛋白。在正常情况下，细胞中p53的含量很低，在DNA损伤或其他条件的刺激下，细胞中的p53含量会增加。当p53发生突变后，则丧失抑癌功能，转为促进细胞恶变的癌基因。现明确p53是细胞生长周期中的负调控因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关，在抑制癌细胞生长过程中有重要作用[13]。p53为bcl-2和bax的上游调控基因，可与bcl-2、Bax共同作用完成对细胞凋亡的调控，野生型p53可下调bcl-2和上调bax基因的表达，从而调控细胞凋亡[14]。

中医认为，肺癌的病因主要有外邪侵淫、邪毒壅滞、正气虚弱、脏腑失调、痰湿内结、瘀毒内蕴等。痰瘀邪毒内结，气阴耗伤，肺失宣降为其主要病机。故临床多以化瘀祛痰，解毒散结，益气养阴为治疗原则。欧阳锜研究员[15]通过长期临床经验和科研实践，所订制以“解毒抗癌”为主的通用方中，用于肺癌之清肺解毒方即重用臭牡丹以清热解毒抗癌。潘敏求教授治疗肺癌常用之肺复方中重用臭牡丹，与白花蛇舌草相配伍清热解毒、散瘀止痛，以抗癌，并获得了很好的临床疗效[16]。有研究[17-18]对欧阳锜经验方“保肺饮”(重用臭牡丹为君药)进行体内外的抗肿瘤实验观察中，发现该方剂对新鲜肺鳞癌、恶性淋巴瘤组织细胞具有明显抑制作用；在体内实验中，发现该方可以明显减轻三甲基胆蒽诱生大鼠肺癌模型的癌性病变程度、炎症并发及体重下降。

本实验结果说明，臭牡丹总黄酮能够抑制Lewis肺癌小鼠实体瘤生长，改善实验动物生存状态，可能是臭牡丹抗肿瘤有效部位之一。其机制可能与上调促细胞凋亡基因p53和bax mRNA的表达有关。该结果为臭牡丹作为临床应用提供了一定实验实依据。

参考文献

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(2016-05-25收稿责任编辑：洪志强)

Inhibition Effect of Clerodendrum Bungei Flavonoinds on Lewis Rats' Lung Tumor and its Correlation to the Expression of p53,bcl-2,and bax Gene

Chen Siqin,Zhu Kejian,Li Yongmin,Zhou Jian

(AffiliatedHospitalofHuNanAcademyofTraditionalChineseMedicine,Changsha410006,China)

AbstractObjective:To explore the effect of clerodendrum bungei steud flavonoids (CBSF) on mice with Lewis lung cancer and its correlation to the expression of p53,bcl-2,and bax.Methods:To select 50 C57BL/6 male mice,after modelling,choose 40 with Lewis lung cancer and randomly divided them into four groups:model group,DDP group,CBSF high dose group,CBSF low dose group (with 10 in each),and 10 healthy mice into blank group.Drug administration:model group:intraperitoneal injection of physiological saline 0.01 mL/g for 14 days; DDP group:intraperitoneal injection of DDP 0.4 mg/kg for 5 days; CBSF high dose group:intraperitoneal injection of CBSF 0.6 g/kg for 14 days; CBSF low dose group:intraperitoneal injection of CBSF 0.3 g/kg for 14 days.Execute all mice after the medication,then weight up the tumors and calculate the tumor inhibition rate.Besides,using real-time PCR method to detect the expression of p53,bcl-2 and bax.Results:1)The effect on tumor ±s).The tumor weight of four groups are as follow:model group (4.70±1.29)g,DDP group (2.24±0.68)g,CBSF high dose group (3.26±1.06)g,CBSF low dose group (3.99±1.31)g.The tumor weight of DDP group and CBSF high dose group are lighter than that of the model group (P<0.05).Besides,there is no significant difference between these two groups (P>0.05).2)The tumor inhibition rate (IR).The IR of DDP group is 53.4%,CBSF high dose group is 30.6%,and CBSF high dose group is 15.1%.3)The effect on gene expression.Both CBSF groups can up-regulate the expression of p53 mRNA and bax mRNA (P<0.05 or P<0.01); DDP group can down-regulate the expression of bcl-2 mRNA (P<0.05) and up-regulate the expression of bax mRNA (P<0.01).Conclusion:Clerodendrum bungei flavonoids can improve the living quality of Lewis lung cancer mice and inhibit growth of tumor.Its antineoplastic mechanisms might be up-regulation of the expression of p53 mRNA and bax mRNA and induce apotosis of tumor.

Key WordsClerodendrum bungei; Flavonoids; Lewis lung cancer; Real-Time PCR

基金项目：国家自然科学基金项目(编号：81503452)

通信作者：朱克俭(1955.12—)，男,研究员,研究方向:内科疑难病证辨治方法,E-mail:0731zkjo@263.net

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.002