进口头孢替安酯体内外抗菌作用的实验研究

韩彬　刘立涛　邵振俊　柏杨　周黎明

(四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室，四川 成都　610041)



进口头孢替安酯体内外抗菌作用的实验研究

韩彬刘立涛邵振俊柏杨周黎明△

(四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室，四川 成都610041)

摘要目的：评价进口头孢替安酯体内外抗菌作用。方法：进口头孢替安酯为试验药，头孢克洛、头孢氨苄、头孢克肟为对照药，测试它们对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克伯杆菌的体外抗菌活性，即最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)；以小鼠为实验动物，用体内保护试验来测量各个药物的半数有效量(50% effective dose，ED50)。结果：对所选的三类细菌而言，较其它3种对照药(头孢克洛、头孢克肟和头孢氨苄)，进口头孢替安酯有更高的MIC；体内抗菌实验中，进口头孢替安酯对大肠埃希菌ED50低于其他3种对照药，对肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的ED50也仅高于头孢克肟，表现出较强的抗菌能力。结论：进口头孢替安酯对三类细菌的MIC高于其他3种对照药，对大肠埃希菌的体内抗菌活性高于其他3种对照药，对肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性仅次于头孢克肟。

关键词：头孢类抗生素；最低抑菌浓度；半数有效量

头孢菌素类(Cephalosporins)是以冠头孢菌培养液中分离的头孢菌素C为原料，其侧链经过不同修饰而得到的一系列半合成抗生素[1]。其优点是抗菌力强、抗菌谱广、对厌氧菌有高效，毒副反应低、临床疗效好、对酸及对各种细菌产生的β-内酰胺酶较稳定等[2]，因而临床应用广泛，用量处于逐年上升趋势，在抗感染治疗中占有十分重要的地位[3]，目前已发展至第四代。

头孢替安属第二代头孢类抗生素[4]，已经被制成多种剂型在临床上作为一线抗生素使用。本研究中的进口头孢替安酯系注射用头孢替安乙酯化而成的口服抗生素，自身并无抗菌作用，口服后在肠道粘膜迅速水解为头孢替安而被吸收最终产生抗菌作用。目前我国所用的头孢替安酯主要为日本武田药品工业株式会社进口产品，关于其研究报道还很少。

因此，本研究拟通过体内外实验对进口头孢替安酯的抗菌作用进行初步研究，以期为临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药品

日本市售头孢替安酯批号：HG179；规格：100mg/(效价)片。日本武田药品工业株式会社生产。头孢克洛胶囊批号：0903001；规格：0.25 g/粒；华北制药集团制剂有限公司生产。头孢氨苄胶囊批号：0812103；规格：0.25 g/粒；石药集团中诺药业(石家庄)有限公司生产。头孢克肟片批号：031201；规格：0.25 g/片；深圳致君制药有限公司生产。所有药品保存条件为密封干燥保存；由成都市宝信生物科技有限公司提供

1.1.2细菌

革兰阳性菌：临床分离金黄色葡萄球菌；革兰阳性菌：临床分离大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌。以上菌株均由四川大学华西药理教研室提供。

1.1.3实验动物

普通健康昆明种(KM)小鼠370只，雌雄各半，四川大学实验动物中心提供，动物批准号SCXK(川)-10-2006，体重18-22 g之间。正式实验前，所有小鼠适应性饲养一周，自由摄食、饮水适应环境。实验过程中遵循3R动物福利原则。

1.1.4试剂及仪器

羧甲基纤维素钠：分析纯；500 g；天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20050825。牛肉膏：BR生化试剂；500 g；北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20061106。蛋白胨：BR生化试剂；250 g；北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20090905。琼脂粉：JAPAN进口；Storage：RT。氯化钠：分析纯；500 g；天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20070602。可溶性淀粉：分析纯；500 g；成都宏博实业有限公司，批号：20001103。酪蛋白水解物：200 g；杭州微生物试剂有限公司，批号：20070213。MH培养基：牛肉浸膏：3 g；可溶性淀粉：1.5 g；酪蛋白水解物：17.5 g；蒸馏水：1000 ml；调pH至7.2，置于103.43 kPa高压灭菌15 min。电子天平：Precisa，型号：XS125A-SCS。超净工作台：苏州集团苏州安泰空气技术有限公司产品。恒温培养箱，锥形瓶，玻璃试管，10mlBP管，测容积玻璃容器，移液枪，注射器等。

1.2方法

1.2.1实验菌株分离纯化

金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌均由临床分离获得，经常规方法由分离鉴定，每株细菌应经琼脂平板划单个菌落分离纯化，实验前挑去单一菌落于35～37℃下适当培养后用于实验。

1.2.2最低抑菌浓度(MIC)测定

采用二倍肉汤稀释法[5]：制备抗菌药物贮存液浓度为1280 mg·L-1。具体操作方法：排列14只试管，其中第1管内加肉汤1.6 ml,其余各管加肉汤1 ml。吸取药物原液0.4 ml加入第1管，充分混匀后吸出1.0 ml加入第2管依次至第13管，第13管弃去1.0 ml，第14管为不含药物的生长对照。此时各管所含药物分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06 mg·L-1。然后在每管内加入制备好的菌悬液(105CFU·ml-1)1 ml，充分混匀。此时第1管至第13管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·L-1。将所有试管置于恒温培养箱中培养16～20 h后，观察结果并记录最小抑菌浓度(MIC)。

1.2.3最小致死菌量(MLD)试验

将临床分离的菌种进行增殖，即实验用菌于感染前一天，挑取2-3个单菌落接种于2 ml MH肉汤，37℃培养6 h，取此菌液0.1 ml转种于10 ml肉汤中，37℃培养18 h，该菌液即为原菌液，为对数生长期。增菌后的对数生长期菌液用无菌生理盐水稀释至0.5麦氏比浊标准，约含5×108CFU·ml-1；该过程记录原菌液的稀释倍数，故可推算原菌液的细菌含量，再用5%酵母液稀释原菌液，配成所需要的5个浓度，如：5×109、5×108、5×107、5×106、5×105CFU·ml-1，均需当日新鲜配制使用。

取健康昆明种小鼠，体重18～22 g，随机分组，每组10只小鼠，雌雄各半，每种菌需要5个实验组，再加上1个对照组，共计16组。吸取上述不同稀释浓度菌液，分别腹腔注射入小鼠体内，每鼠0.5 ml，感染后观察7～14 d，并记录小鼠死亡数，以引起小鼠100%死亡的最低菌量作为最小致死菌量(MLD)，用该菌量作为体内保护试验的感染菌量。对照组腹腔注射0.5 ml无菌生理盐水。

1.2.4体内保护试验

试验用药均用0.5%CMC(羧甲基纤维素)将所需试验的药物制备成颗粒均匀的混悬液(口服灌胃用)。即在上述实验中求每种受试菌最小致死菌量(MLD)后，还需要得到每种药物100%小鼠死亡与未出现死亡的剂量浓度，在该剂量范围内设5个剂量组，精确称取药物，按效价将其换算到药物重量，用0.5%CMC将各受试药物稀释至所需浓度，制备成颗粒均匀的混悬液，剂量组间距为1：0.6。分别配备以下实验用药：进口头孢替安酯、头孢克洛、头孢氨苄、头孢克肟。

按照体内保护试验方法[5]，四种抗生素每种药物各需50只小鼠，再加1个对照组，共计210只小鼠。将小鼠试验前18 h停食供水，按体重随机分组，每组10只小鼠，雌雄各半，分别于腹腔感染试验菌液，每鼠0.5 ml，感染后即刻按设计剂量口服灌胃给药。四小时后，重复给药一次，观察并记录小鼠死亡数，连续观察7～14 d，根据小鼠死亡数，用SPASS17.0软件进行统计，计算半数有效量ED50。

2结果

2.1最低抑菌浓度

经过二倍肉汤稀释法检测，各类抗生素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的MIC值如下表所示。对此三类细菌而言，头孢克肟显示出最强的抗菌活性，进口头孢替安酯MIC不低于其他3种对照药，如表1所示。

表1　最低抑菌浓度(MIC，mg·L-1)

2.2最小致死菌量

大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的最小致死菌量分别如表2所示。

表2　最小致死菌量(MLD，CFU·ml-1)

2.3半数有效量

以上述菌量作为体内保护试验的感染菌量。经过体内抗菌实验可看出，对大肠埃希菌的抗菌活性高于其他3种对照药，对肺炎克雷伯菌及革兰阳性菌金黄色葡萄球菌的抗菌作用仅次于头孢克肟，如表3所示。

表3　半数有效量(ED50，mg·kg-1)

3讨论

头孢类抗菌药物发展迅速，新型的药物不断出现，在抗感染治疗中占有非常重要的地位。在投入市场前，应有充分的试验来证明新药的抗菌潜力，以便大规模生产，使药物的普及率提高。

头孢替安酯的活性成份头孢替安是第二代头孢菌素[6]，抗菌特点是抗菌谱较第一代广，对革兰阳性菌的抗菌作用与第一代相近；对需氧革兰阳性菌具良好抗菌作用，对部分肠杆菌科细菌亦具一定抗菌活性，且抗酶性能强，肾毒性也较小。目前而言，多数病原菌对包括头孢替安在内的第二代头孢菌素仍然比较敏感，同时，头孢替安在肾脏、胆汁、气管分泌物和腹腔液中可具有较高的浓度,并且多以原形由尿中排泄[7]。因此，头孢替安的有效剂型，应用于包括下呼吸道感染、尿路感染、腹腔感染在内的各种院外感染有着非常好的前景[8]。而且临床上，医生需严格掌握抗生素应用原则及联合应用指征[9,10]，合理应用抗生素，必要时，尤其是混合感染可联合使用抗生素，同时意避免拮抗作用。这样，口服抗生素剂型因为给药、吸收方式有别于静脉给药剂型，在抗生素联用过程中显示出了独特的优势，拥有一定的推广意义。

我们以进口头孢替安酯为目标研究药物，选取了头孢克洛、头孢氨苄、头孢克肟作为对照药品，以期观测进口头孢替安酯的体内外抗菌活性。结果表明：在药物敏感试验中，进口头孢替安酯对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的MIC值都不低于其他3种对照药，但仍显示出较强的抗菌活性；而抗生素体内保护试验中，进口头孢替安酯对大肠埃希菌抗菌作用强于所选全部对照药；对肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌而言，进口头孢替安酯的抗菌活性也仅次于头孢克肟，高于其他另外两种对照药，结果提示我们进口头孢替安酯是拥有较强的体内抗菌活性的。

综上所述，我们认为进口头孢替安酯的抗菌表现已经不输于其他三类一线抗生素，值得临床推广。进口头孢替安酯的单独使用，或和其他抗生素的联用怎样才能在尽量减轻药物副反应和相互作用的前提下到达药物效价最大化，则需要更深入基础和临床研究。

参考文献

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2刘旻虹,狄斌,刘文英. 头孢菌素类抗生素——头孢替坦的研究进展[J]. 抗感染药学, 2008, 5(4): 209-214.

3罗圣平,易小红,刘芳. 2004～2008年我院头孢菌素类抗生素应用分析[J]. 中国医院用药评价与分析, 2009, 9(2): 100-103.

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9DhiwakarM, Eng CY, Selvaraj S, et al. Antibiotics to improve recovery following tonsillectomy: a systematic review[J]. Otolaryngol Head Nec, 2006, 134(3): 357-364.

10Llor C. Antibiotics should be given only to patientswith moderate-to-severe COPD[J]. Am J Med, 2006, 119(2): 186-187.

Antibacterial activity of imported cefotiam hexetil in the vivo &vitro trial

Han Bin, Liu Li-tao, Shao Zhen-jun, Bai Yang, Zhou Li-ming△

(Department of Pharmacology, West China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

AbstractObjective：To evaluate the antibacterial activity of imported cefotiam hexetil in the vivo & vitro trial. Methods: Taking imported cefotiam hexetil as test drug, cefaclor, cephalexin and cefixime as the control drugs, we tested the antibacterial activities of them to Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus pneumonia Kerber in vitro experiments, namely, the minimum inhibitory concentration (MIC); and perform vivo protection test to measure 50% effective dose (ED50) of various drugs in mice experiments after injecting the above bacteria in peritoneal. Results: In vitro trial，imported cefotiam hexetil showed higher MICs than the rest three kinds of control drugs (cefaclor, cefixime and cephalexin); the ED50of imported cefotiam hexetil against Escherichia coli was lower than control drugs, and the ED50s against Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus were only higher than cefixime, imported cefotiam hexetil showed strong antibacterial capacity in vivo experiments. Conclusion: MICs of imported cefotiam hexetil against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus pneumonia Kerber were higher than the rest three kinds of control drugs In vitro experiments; imported cefotiam hexetil manifested strongest antibacterial activity to Escherichia coli and second and strongest antibacterial activity to Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae.

Key Words:Imported cefotiam hexetil; Minimum inhibitory concentration; 50% effective dose

作者简介：韩彬，男，博士研究生，主要从事分子药理学研究，Email：182420961@qq.com。 △通讯作者：周黎明，女，教授，主要从事分子药理学研究，Email：zhou108@163.com。

(收稿日期：2016-5-26)