电针腧穴对肾绞痛大鼠镇痛作用及其机制研究

肖 扬，王锋锋，熊 杰，孟 磊，姚睿智，王 峻，庄礼兴，陈 铭



·论著·

电针腧穴对肾绞痛大鼠镇痛作用及其机制研究

肖 扬，王锋锋，熊 杰，孟 磊，姚睿智，王 峻，庄礼兴，陈 铭

510120广东省广州市，广州中医药大学第一临床医学院(肖扬，熊杰)；广州中医药大学第一附属医院(王锋锋，孟磊，姚睿智，王峻，庄礼兴，陈铭)

【摘要】目的探讨电针腧穴对肾绞痛大鼠的镇痛作用，并分析其镇痛机制。方法2015-03-31至2015-04-28选取SPF级雄性SD大鼠26只，依据随机数字表法将所有大鼠分为正常组8只、模型组8只、电针组10只，适应性喂养7 d后，第8天起造模，正常组大鼠自由饮用蒸馏水，模型组及电针组大鼠自由饮用诱石剂水(1%乙二醇溶液+1%氯化铵水溶液)，连续10 d，建立草酸钙结石致大鼠肾绞痛模型。造模成功后模型组及电针组均死亡1只。电针组大鼠选穴肾俞、三焦俞、三阴交和水泉进行电针治疗，共治疗3 d。治疗结束后第2天处死3组大鼠取材。比较造模后治疗前(后统称治疗前)及治疗第1、2、3天3组大鼠痛阈、模型组及电针组自发性疼痛评分，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测3组大鼠肾组织中血栓素A2(TXA2)、前列环素(PGI2)、5-羟色胺(5-HT)表达水平，观察取材后各组大鼠左肾组织病理学改变情况。结果治疗方法与时间在大鼠痛阈上存在交互作用(P<0.05)；治疗方法和时间在大鼠痛阈上主效应显著(P<0.05)；治疗前及治疗第1、2天模型组、电针组大鼠和治疗第3天模型组大鼠痛阈均短于正常组(P<0.05)；治疗第1、2、3天电针组大鼠痛阈均长于模型组(P<0.05)。治疗方法与时间在大鼠自发性疼痛评分上存在交互作用(P<0.05)；治疗方法和时间在大鼠自发性疼痛评分上主效应显著(P<0.05)；治疗第1、2、3天电针组大鼠自发性疼痛评分均低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平及电针组大鼠肾组织PGI2表达水平均高于正常组(P<0.05)；电针组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平均低于模型组(P<0.05)。正常组大鼠肾脏内未见草酸钙结晶沉积，肾小球形态规则，周围组织无充血、无炎性细胞浸润，肾小管无扩张，细胞排列整齐，结构清晰。模型组大鼠肾小球形态规则，周围组织充血水肿且炎性细胞浸润，肾小管扩张明显且见草酸钙结晶，细胞排列紊乱，上皮细胞脱落坏死。电针组大鼠肾小球形态规则，周围组织少许充血且炎性细胞浸润，肾小管扩张但未见明显草酸钙结晶，细胞排列整齐，结构清晰，未见上皮细胞脱落坏死。结论电针腧穴对肾绞痛大鼠具有镇痛作用，且机制可能与下调炎性递质PGI2、TXA2及神经递质5-HT表达水平有关。

【关键词】电针；肾绞痛；大鼠；针刺镇痛；血栓素A2；前列环素；血清素

肖扬，王锋锋，熊杰，等.电针腧穴对肾绞痛大鼠镇痛作用及其机制研究[J].中国全科医学，2016，19(18)：2206-2210.[www.chinagp.net]

Xiao Y, Wang FF, Xiong J, et al.Analgesic effect and mechanism of electroacupuncture acupoints in renal colic rats[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2206-2210.

祖国医学将肾绞痛归属于“淋证”、“腰痛”等范畴，其病位在肾与膀胱。《中藏经·论淋沥小便不利》中“砂淋者，腹脐中隐痛，小便难，其痛不可忍，须臾从小便中下如砂石之类，有大者如皂子，或赤或白(一作黄)，色泽不定”，其较早地对因泌尿系结石导致肾绞痛的临床症状进行了描述。肾绞痛的主要发病机制在于砂石羁留、阻遏络脉，于是气血运行不畅，不通则痛。电针是在普通针刺的行气通经、活血止痛基础上，加以脉冲电治疗，针电结合，加强止痛、镇静，促进气血循环。笔者为探讨电针的镇痛机制，加以腧穴特性，以炎性递质和神经递质为切入点，观察肾绞痛大鼠模型的行为学、组织学、炎性递质及神经递质的表达水平，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物2015-03-31至2015-04-28选取SPF级雄性SD大鼠26只，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物编号：SCXK(粤)2013-0034；月龄2～3个月，体质量180～220 g。动物实验在广州中医药大学第一附属医院SPF级别动物实验室完成，环境设施许可证号：SYXK(粤)2013-0092；饲养条件：环境温度20 ℃，湿度40%～70%，黑暗和照明时间各12 h。

1.1.2实验试剂及仪器乙二醇溶液、氯化铵及40%甲醛溶液(上海晶纯生化科技股份有限公司)；水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂)；华佗牌无菌针灸针及华佗牌SDZ-Ⅱ电针仪(苏州医疗用品厂有限公司)；大鼠血栓素A2(TXA2)、前列环素(PGI2)和5-羟色胺(5-HT)试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司，批号：201503)；总蛋白(TP)测定试剂盒(带标准：考马斯亮蓝法)(南京建成生物工程研究所，批号：20150326)；赛默飞世尔THERMO Multiskan MK2全自动酶标仪；日本奥林巴斯cx21-BIM型生物显微镜。

本研究背景及创新点：

国内外关于肾绞痛的治疗多以西药、手术为主，西药以非甾体抗炎药、麻醉类镇痛药、解痉类药物为首选，而中医中药在治疗方法中属备选方法，主要因为中医中药观察指标以主观为主，并缺乏相关科学、客观的机制研究。目前，随着中医中药的逐渐发展，电针治疗已得到国内外的广泛认可，但各大数据库收录关于电针治疗肾绞痛的文献均以临床研究为主，且尚未见关于电针治疗肾绞痛的机制研究。本研究通过采用电针腧穴对肾绞痛大鼠进行镇痛治疗，并进行相关机制的研究，初步探讨电针腧穴的镇痛机制，为电针的治疗提供更加科学的依据。

1.2实验分组及造模依据随机数字表法将所有大鼠分为正常组8只、模型组8只、电针组10只。适应性喂养7 d后，第8天起造模，正常组大鼠自由饮用蒸馏水，模型组及电针组大鼠自由饮用诱石剂水(1%乙二醇溶液+1%氯化铵水溶液[1])，连续10 d，建立草酸钙结石致大鼠肾绞痛模型。

1.3实验方法造模成功后模型组及电针组均死亡1只，之后两组均改为饮用蒸馏水。电针组大鼠选穴肾俞、三焦俞、三阴交和水泉，具体位置：腧穴位于第2腰椎棘突下，旁开约3 mm处；三焦俞位于第1腰椎棘突下，旁开约3 mm处；三阴交位于后肢内侧，内踝尖正上方约6 mm处；水泉位于后肢内侧后下方，内踝尖与跟腱凹陷处正下方2 mm处[2]。针具及操作方法：针具选用美容针(0.14 mm×13.00 mm)；直刺进针，进针约2～3 mm，将电针治疗仪两个电极(不分正负极)分别接在同侧肾俞与三焦俞、三阴交与水泉穴位上，选用连续波，频率2 Hz，电流1 mA，强度以引起大鼠肢体轻微抖动为宜，留针15 min，1次/d，共治疗3 d。治疗结束后第2天处死3组大鼠，并取肾组织进行进一步研究。

1.4观察指标

1.4.1行为学观察观察造模前、造模后治疗前(后统称治疗前)及治疗第3天3组大鼠精神状态、行动情况、皮毛颜色及光泽、大小便情况等，并比较治疗前及治疗第3天3组大鼠的体质量。

1.4.2痛阈分别于治疗前及治疗第1、2、3天测量3组大鼠的痛阈。在束缚并限制活动的条件下，采用水温为(50.0±0.2)℃的热水浸烫大鼠尾部4 cm，记录入水至甩尾出水的时间则为痛阈，测量3次，取平均值。

1.4.3自发性疼痛评分治疗前及治疗第1、2、3天参照Attal等[3]评分方法对模型组和电针组大鼠进行自发性疼痛评分测定。将模型组和电针组大鼠置于观测盒内，自由活动适应环境后开始观察，观察时间为15 min。疼痛行为共6级：0分为动物无任何行为异常；1分为动物爪部轻度屈曲；2分为爪部屈曲明显，并向外侧翻；3分为动物侧卧，爪部以内侧缘与玻璃板接触，但不承重；4分为动物抬足，不与玻璃板接触；5分为动物除抬足外，并有舔咬足趾表现，甚至呈弓腰状。

1.4.4肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平取材后将大鼠右肾组织通过机械匀浆方法提取蛋白，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，以均一的蛋白浓度采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行检测，检测方法严格按照试剂盒说明书进行；采用酶联免疫检测仪在450 nm处分别测定各组TXA2、PGI2和5-HT吸光度，绘制标准曲线(R2>0.99)，根据标准曲线计算出待测样品的表达水平。

1.4.5病理学检查取材后将大鼠左肾组织采用10%甲醛溶液固定24 h，常规进行石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察左肾组织病理学改变情况。

2结果

2.1行为学观察造模前：3组大鼠精神状态良好，行动灵活，毛色光泽，饮食及大小便正常。治疗前：正常组大鼠无死亡，精神状态良好，行动灵活，毛色光泽，饮食及大小便正常；模型组及电针组大鼠均死亡1只，且均精神萎靡不振，蜷缩懒动，时有爪部屈曲、弓腰，毛色粗糙，饮食及大小便减少。治疗第3天：正常组大鼠精神状态良好，行动灵活，毛色光泽，饮食及大小便正常；模型组大鼠无死亡，精神状态一般，行动情况一般，时有爪部屈曲、弓腰，毛色粗糙，饮食及大小便较治疗前增加；电针组大鼠无死亡，精神状态一般，行动情况一般，毛色粗糙，饮食及大小便较治疗前电针组及治疗后模型组增加。3组大鼠治疗前与治疗第3天体质量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；且模型组、电针组大鼠治疗前与治疗第3天体质量均低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗第3天模型组、电针组大鼠体质量均高于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.23组大鼠治疗前及治疗第1、2、3天痛阈比较治疗方法与时间在大鼠痛阈上存在交互作用(P<0.05)；治疗方法和时间在大鼠痛阈上主效应显著(P<0.05)。治疗前及治疗第1、2天模型组、电针组大鼠和治疗第3天模型组大鼠痛阈均短于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗第1、2、3天电针组大鼠痛阈均长于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.32组大鼠治疗前及治疗第1、2、3天自发性疼痛评分比较治疗方法与时间在大鼠自发性疼痛评分上存在交互作用(P<0.05)；治疗方法和时间在大鼠自发性疼痛评分上主效应显著(P<0.05)。治疗第1、2、3天电针组大鼠自发性疼痛评分均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table 1Comparison of body mass among the three groups of rats before treatment and on the third day of treatment

组别只数治疗前治疗第3天t配对值P值正常组8367±33361±400.3780.716模型组7231±36a292±25a-3.7620.009电针组9209±33a276±36a-4.2520.003F值53.09314.882P值<0.001<0.001

注：与正常组比较，aP<0.05

Table 2Comparison of pain threshold among the three groups before treatment and on day 1,2,3 of treatment

组别只数治疗前治疗第1天治疗第2天治疗第3天正常组811.1±0.911.4±1.310.8±1.310.7±1.1模型组76.7±1.4a5.7±1.1a6.1±1.2a7.2±1.1a电针组96.0±1.3a8.3±0.9ab8.1±1.0ab10.4±1.5bF值F交互=8.330,F组间=93.271,F时间=7.828P值P交互<0.001,P组间<0.001,P时间<0.001

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

Table 3Comparison of spontaneous pain score between the two groups before treatment and on day 1,2,3 of treatment

组别只数治疗前治疗第1天治疗第2天治疗第3天模型组78.0±1.87.6±1.46.9±2.04.3±1.1电针组97.9±1.63.2±1.7a3.8±1.6a1.2±1.0aF值F交互=5.040,F组间=52.381,F时间=28.034P值P交互<0.001,P组间<0.001,P时间<0.001

注：与模型组比较，aP<0.05

2.43组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平比较3组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平及电针组大鼠肾组织PGI2表達水平均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

2.53组大鼠左肾组织病理学检查正常组大鼠肾脏内未见草酸钙结晶沉积，肾小球形态规则，周围组织无充血、无炎性细胞浸润，肾小管无扩张，细胞排列整齐，结构清晰。模型组大鼠肾小球形态规则，周围组织充血水肿且炎性细胞浸润，肾小管扩张明显且见草酸钙结晶，细胞排列紊乱，上皮细胞脱落坏死。电针组大鼠肾小球形态规则，周围组织少许充血且炎性细胞浸润，肾小管扩张但未见明显草酸钙结晶，细胞排列整齐，结构清晰，未见上皮细胞脱落坏死(见图1，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

Table 4Comparison of kidney TXA2,PGI2 and 5-HT expressions among the three groups

组别只数TXA2PGI25-HT正常组820.6±1.96.4±0.627.2±1.5模型组724.2±2.0a8.4±0.7a32.5±1.2a电针组919.5±2.5b7.2±0.7ab27.2±2.2bF值9.99018.23223.942P值0.001<0.001<0.001

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；TXA2=血栓素A2，PGI2=前列环素，5-HT=5-羟色胺

3讨论

急性肾绞痛在我国南方地区具有较高的发病率。在盛夏季节，约30%的患者因急性肾绞痛就诊于急诊外科门诊，剧烈的疼痛让患者急切渴望临床医生给予简便、有效、迅速的镇痛治疗。肾绞痛治疗的首要目标是止痛，常用非甾体抗炎药或阿片类镇痛药，但药物镇痛存在较多不良反应且易成瘾，因此临床使用受到一定限制。中医针灸尤其擅长治疗各类痛症，其具有起效迅速、简便易行、持续镇痛且无不良反应的特点，因此广泛应用于头痛、四肢关节痛、牙龈肿痛、颈肩腰部疼痛等各类痛症的治疗[4-9]。针灸配以微量低频脉冲电流，具有调节细胞膜离子平衡，舒张平滑肌及血管，解除痉挛和改善循环，而且还可通过反馈痛觉中枢及抑制各类炎性递质及神经递质起到镇痛作用[10-14]。电针是中医针灸结合现代科技发展的重要成果，在肾绞痛镇痛治疗方面疗效显著。目前，国内外尚未见关于电针对肾绞痛的镇痛作用机制的研究，本研究通过炎性递质和神经递质作为切入点，探讨电针对肾绞痛的镇痛效果及其作用机制，为电针的临床应用提供客观、科学的依据。

针灸配穴是中医辨证论治的重要体现，肾俞、三焦俞为脏腑之气输注于背的俞穴，属足太阳膀胱经。《外台秘要》中“肾俞主腰痛不可俯仰反侧……少腹急痛热”指出，肾俞具有补虚壮腰、益肾填精之功。《铜人针灸经》中“三焦俞主肩背拘急，腰脊强”指出，三焦俞具有运化水谷、通调水道之功。三阴交为足三阴经交会之处，统治脾、肝、肾三阴经所主疾患，肝藏血，脾统血，肾藏精，精血同源，气血互生，具有补血分之虚、清血分之热、行血分之滞、活血分之瘀的功效。水泉为足少阴肾经的郄穴，是肾经气血深聚之处，既治循经之症，亦作阴经郄穴治急性血症，有通经调血、疏利下焦之功。肾绞痛乃砂石羁留，阻遏络脉，气血瘀滞，发为腰痛。腰为肾府，取肾俞、三焦俞可取近治之效，配以三阴交、水泉，解血分之瘀滞。三焦俞可疏通气机，配以肾俞、水泉有通利下焦，砂石自下。诸穴相配，共奏行气活血、化瘀止痛、通淋排石之功效。

本研究结果显示，治疗前及治疗第1、2天模型组、电针组大鼠和治疗第3天模型组大鼠痛阈均短于正常组；治疗第1、2、3天电针组大鼠痛阈均长于模型组、自发性疼痛评分均低于模型组，表明电针肾俞、三焦俞、三阴交、水泉等穴位可改善肾绞痛大鼠的痛阈及自发性疼痛评分。进一步进行机制分析，结果显示，模型组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平及电针组大鼠肾组织PGI2表达水平均高于正常组；电针组大鼠肾组织TXA2、PGI2、5-HT表达水平均低于模型组；模型组大鼠肾小球形态规则，周围组织充血水肿且炎性细胞浸润，肾小管扩张明显且见草酸钙结晶；电针组大鼠肾小球形态规则，周围组织少许充血且炎性细胞浸润，肾小管扩张但未见明

注：A为正常组，B为模型组，C为电针组

图13组大鼠左肾组织病理图(HE染色，×200)

Figure 1Left kidney tissue pathology of the rats in the three groups

显草酸钙结晶；表明电针腧穴可降低肾组织中TXA2、PGI2和5-HT表达水平以及减轻肾小管扩张及炎性细胞浸润，其机制可能为电针腧穴抑制炎性递质及神经递质的合成，从而减轻5-HT致痛作用。TXA2、PGI2和5-HT等在肾绞痛的发生发展中扮演重要的角色，3者除具有明显的致痛作用外，PGI2、TXA2作为花生四烯酸连锁反应的重要产物,PGI2具有较强的血管扩张作用,肾小球有效滤过率增多，从而加重梗阻。而TXA2具有强烈平滑肌收缩作用，使肾小管管腔内压力进一步升高，疼痛增加[15-17]。5-HT是由血小板释放自体活性物质，TXA2表达水平升高导致血小板聚集，释放更多的5-HT，既可引起平滑肌收缩，也可作用于感觉神经末梢增加致痛作用[18-19]。因此，TXA2、PGI2和5-HT可能是电针治疗肾绞痛的重要靶点之一。

基于中医理论基础及经络腧穴理论，结合镇痛机制的初步探讨结果，对电针治疗肾绞痛提供科学、客观的依据，让电针治疗肾绞痛有理可循。而疼痛是炎性递质、神经递质、电生理活动、微循环血流动力学等因素相互作用的结果，电针镇痛的原理包括神经化学机制、神经生理机制、分子机制和效应机制等多个方面。本研究从炎性递质及神经递质方面进行探讨论述，未来还需进一步围绕电生理、微循环血流动力学等开展，以探讨电针治疗肾绞痛的综合镇痛机制。

综上所述，电针腧穴对肾绞痛大鼠的镇痛作用显著，其能有效改善大鼠的痛阈及自发性疼痛评分、减轻肾小管扩张及炎性细胞浸润，其机制可能与TXA2、PGI2和5-HT表达水平变化有关，为临床使用电针治疗肾绞痛提供客观依据。

作者贡献：肖扬进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；王锋锋、熊杰、孟磊进行实验实施、评估、资料收集；姚睿智、王峻、庄礼兴、陈铭进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：毛亚敏)

Analgesic Effect and Mechanism of Electroacupuncture Acupoints in Renal Colic Rats

XIAOYang,WANGFeng-feng,XIONGJie,etal.

TheFirstClinicalMedicalSchool,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510120,China

【Abstract】ObjectiveTo study the analgesic effect and mechanism of electroacupuncture(EA) acupoints in renal colic rats.MethodsFrom March 31,2015 to April 28,2015,26 male SD rats in a SPF grade were selected and divided into normal group(n=8),model group(n=8) and EA group(n=10) by random number table method.The rats were fed adaptively for 7 days.From the 8th day,the rats in normal group were free to drink water,the rats of another groups were free to drink stone inducing agent(1% ethylene glycol solution and 1% ammonium chloride aqueous solution) for 10 days to establish renal colic models induced by calcium oxalate stone.There were two deaths including one in model group and one in EA group after models were established successfully.The electroacupuncture was applied to "Shenshu"(BL23),"Sanjiaoshu"(BL22),"Sanyinjiao"(SP6) and "Shuiquan"(KI5) in the rats in EA group for 3 days.Rats were executed on the next day after treatment ended.Before treatment and on day 1,2,3 of treatment, pain threshold value was compared among the three groups, spontaneous pain score was compared between model group and EA group， the TXA2, PGI2 and 5-HT expressions among the three groups were detected by ELISA method, the pathological changes of the left kidney tissue of each group were observed after biopsies.ResultsThere was interaction effect between treatment measure and time in pain threshold value(P<0.05);the main effect between treatment measure and time was significant in pain threshold value(P<0.05);Rats in model group and EA group had lower pain threshold than normal group before treatment,and on the first and second day of treatment (P<0.05);the rats in model group had lower pain threshold than normal group on the third day of treatment(P<0.05);the rats in EA group had higher pain threshold than model group on day 1,2,3 of treatment (P<0.05).There was interaction effect between treatment measure and time in the score of spontaneous pain(P<0.05);the main effect between treatment measure and time was significant in the score of spontaneous pain(P<0.05);the rats in EA group had lower score of spontaneous pain than model group on day 1,2,3 of treatment (P<0.05).The rats of model group were higher than normal group in the expressions of TXA2，PGI2 and 5-HT in renal tissue,and EA group was higher than normal group in the expression of PGI2 in renal tissue (P<0.05);the rats of EA group were lower than model group in the expressions of TXA2，PGI2 and 5-HT in renal tissue (P<0.05).For normal group,no calcium oxalate crystal deposit was observed in kidney;glomerular morphology was regular;no congestion in surrounding tissue,no infiltration of inflammatory cells,and no expansion of kidney tubules were found;the cells were in alignment and clear structure.For model group,glomerular morphology was regular;congestion and edema in surrounding tissue,infiltration of inflammatory cells,obvious expansion of kidney tubules,and calcium oxalate crystal deposit were noted;the cells were in disorder,and epithelial cells fell off and were necrotic.For EA group,glomerular morphology was regular;slight congestion and infiltration of inflammatory cells in surrounding tissue,and expansion of kidney tubules were noted,but no calcium oxalate crystal deposit was observed;the cells were in disorder and clear structure;no epithelial cells fell off and were necrotic.ConclusionThe EA acupoints treatment has analgesic effect on renal colic rats.The therapeutic mechanism is possibly achieved by inhibiting the expressions of inflammatory mediators TXA2,PGI2 and neurotransmitter 5-HT.

【Key words】Electroacupuncture；Renal colic;Rats;Acupuncture Analgesia；Thromboxane A2;Epoprostenol;Serotonin

通信作者：陈铭，510120广东省广州市，广州中医药大学第一附属医院；E-mail：chenming0953@sohu.com

【中图分类号】R 691.4

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.019

(收稿日期：2016-01-23；修回日期：2016-05-06)

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