VITEK-MS系统直接鉴定体液培养阳性标本的研究

杨　羚　莫晓彦　陈定强

广州医科大学附属第一医院检验科(广州 510120)



VITEK-MS系统直接鉴定体液培养阳性标本的研究

杨羚莫晓彦陈定强

广州医科大学附属第一医院检验科(广州 510120)

【摘要】目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(VITEK-MS)对体液培养阳性瓶进行直接鉴定，探索快速诊断临床致病菌的新策略。方法收集体液培养阳性瓶，不经琼脂平板培养，直接利用VITEK-MS进行鉴定，并与传统生化鉴定的方法进行比较分析。结果50例体液培养阳性瓶中，传统细菌鉴定法检出47株阳性菌，3例阴性；而VITEK-MS直接鉴定法检出31株阳性菌，同样3例阴性。VITEK-MS直接鉴定法灵敏度达65.96%，特异度为100%，临床符合率为68%。鉴定时间从24小时缩短到2小时。结论利用VITEK-MS质谱系统直接鉴定体液培养阳性标本中的病原菌，能有效缩短细菌鉴定时间，准确快速地诊断临床致病菌。

【关键词】VITEK-MS质谱鉴定系统体液培养阳性直接鉴定

目前鉴定体液培养瓶病原菌的主流方法是传统细菌鉴定方法，需要将体液培养阳性瓶中菌液接种至平板上培养18～24 h，再进行生化鉴定或采用细菌自动鉴定仪检测，全过程达18～48 h，严重阻碍了临床对感染的控制和治疗。因此，建立一种简单、快速、广谱和有效的鉴定体液培养瓶病原菌方法是非常必要的[1]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)是可用于微生物鉴定的一种新型技术,商品化的快速发展使得这项技术逐渐应用于临床微生物实验室,补充了传统的基于生化及表型测定的鉴定方法耗时长的不足。VITEK-MS是利用MALDI-TOF质谱技术来分析样本菌株蛋白组成成分并获得特征性的峰谱，再与数据库中细菌图谱进行比较，如能吻合即可做出判断，从而快速鉴定细菌。它具有鉴定时间短，鉴定广泛和准确的特点。鉴定的样本既可以是分离培养的纯菌落,也可以是原始的临床样本通过浓缩、纯化或进行预处理得到细菌蛋白,不经分离培养直接用于检测[2-4]。本实验利用VITEK-MS系统直接鉴定体液培养中的病原菌，可将鉴定时间缩短为2 h，探究了与传统方法相比，此方法直接鉴定的效果和应用前景，为快速诊断血液感染的致病菌提供依据。

1材料与方法

1.1细菌来源收集2015年7月—10月间广州医科大学附属第一医院微生物室BacT/ALERT 3D全自动培养仪上当天报阳的体液培养瓶，并于当天完成预处理进行直接鉴定。

1.2仪器和试剂无水乙醇、甲酸购于广州化学试剂厂；乙腈购于美国spectrum公司；皂素购于生工生物工程上海股份有限公司；质谱样品处理基质溶液、VITEK-MS DS靶板、VITEK-MS仪购于生物梅里埃中国有限公司；质控菌株为 ATCC8739菌株。

1.3预处理提取细菌蛋白[4]抽取报阳体液培养瓶中1 mL样本于1.5 mL离心管，加入200 μl 5%皂素溶液[8]。室温静置5 min后，13000 rpm离心1 min，弃去上清液。再加入1 mL去离子水，13000 rpm离心1 min，弃去上清液。再加入100 μl去离子水，震荡重悬后，加入300 μl无水乙醇，13000 rpm离心2 min，弃去上清液。后加入甲酸和乙腈50 μl，震荡重悬后，13000 rpm离心2 min。所得上清液即为细菌蛋白。全程耗时约为1 h。

1.4点种靶板与鉴定挑取少量前一天转种的ATCC8739质控菌株的单个菌落点种于靶板质控孔，并吸取1 μl质谱样品处理基质溶液覆盖点种的菌膜；吸取1μl提取的上清液分别点种在靶板的样品孔，室温待干，并吸取1 μl质谱样品处理基质溶液覆盖样品，待靶板的孔全部干燥后，使用VITEK-MS系统进行鉴定。全程30～50 min，取决于样品孔干燥的时间。

1.5传统细菌鉴定收集BacT/ALERT3D全自动培养仪上当天报阳的体液培养瓶，接种于血平板和巧克力平板上，在5%CO2、37 ℃培养18～24 h后, 挑取菌落，并使用VITEK-MS微生物鉴定仪进行鉴定。

1.6鉴定结果的数据分析VITEK-MS系统工作站的直接鉴定结果包括能够鉴定到种或属、鉴定出两种及两种以上致病菌待选择、频谱错误、无鉴定结果、峰谱不足情况。统计时将鉴定到种或属，且置信度大于90%，视为实验结果阳性；无鉴定结果视为实验结果阴性；而鉴定出两种及两种以上致病菌待选择、频谱错误、峰谱不足的情况则视为细菌鉴定不出。本研究将传统细菌鉴定法的鉴定结果作为金标准，与之比较，继而计算出阳性符合率、临床符合率及该方法的灵敏度和特异度。阳性符合率是统计VITEK-MS直接鉴定到种或属的样本与传统鉴定法中阳性样本的符合程度；临床符合率为本实验方法所有直接鉴定结果与传统鉴定方法的结果相一致的比率。灵敏度为传统鉴定方法检出的阳性标本中，用MS直接鉴定法能鉴定出阳性的比率；特异度为传统鉴定方法检出的阴性标本中，用MS直接鉴定法能鉴定阴性的比率。

2结果

2.1传统鉴定方法结果50例报阳体液培养瓶通过传统细菌鉴定方法，发现47例检出细菌，其中包括37例革兰阴性杆菌和10例革兰阳性球菌。有3例未检出细菌，为阴性结果(见表1)。

2.2VITEK-MS直接鉴定法结果与传统鉴定法比较，47例阳性菌株中有26例在细菌种水平完全相符，5例在细菌属的水平完全相符，每个样本的置信度>90%，总的阳性符合率为65.96%(31/47)。而且，传统鉴定法未检出的3例样品中，直接鉴定法也同样为阴性。其中， 与传统方法比较，革兰阴性杆菌鉴定到菌种相同的有48.65%(18/37),鉴定到属相同的有13.51%(5/37)，阳性符合率为62.16%(23/37)。革兰阴性杆菌中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌最为常见，大肠埃希菌的直接鉴定效果较差为33.33%(6/18)，而肺炎克雷伯菌直接鉴定效果最好为92.86%(13/14)。而革兰阳性球菌鉴定到种与传统方法相同的有80%(8/10),阳性符合率为80%(8/10)。可以看出，革兰阳性球菌的阳性符合率高于革兰阴性杆菌(见表1)。

表1　50例报阳培养瓶VITEK-MS

2.3各标本类型的阳性符合率临床采集的标本类型以血液和胆汁较为常见。与传统方法比较，胆汁直接鉴定的阳性符合率达到90%(9/10)，优于血液的直接鉴定效果62.5%(15/24)；胸腹水和脓液采集的相对较少，鉴定的阳性符合率分别为66.7%(4/6)和60%(3/5)(见表2)。

表2　不同标本类型的VITEK-MS

2.4直接鉴定法的方法学特点本研究以传统细菌鉴定方法作为金标准，将直接鉴定法的结果与之比较，得出该实验方法的灵敏度为65.95%(31/47)，特异度为100%(3/3)，临床符合率为68%(34/50)(见表3)。

表3　两种方法的方法学比较

3讨论

MALDI-TOF MS是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离有机质谱，逐渐应用于生命科学及相关学科。同时作为一项新兴的微生物鉴定技术，已受到国内外的广泛关注[5]。生物梅里埃公司的VITEK-MS就是基于MALDI-TOF原理的运用于微生物鉴定的全自动质谱系统，在2012年8月通过SFDA的批准后，标志了MALDI-TOF MS真正进入临床微生物诊断。近年来VITEK-MS已成功应用于微生物的鉴定，在细菌、酵母菌等鉴定方面均有良好的应用价值，与传统的生化及表型鉴定方法对比，VITEK-MS具有操作简单、快速、自动化程度高、高通量的特点[6]。

VITEK-MS既可以对临床标本分离出的纯菌落进行检测，也可以对临床上未经分离培养的标本进行直接检测[4]。我院微生物室现行传统体液培养阳性菌株鉴定方法是分离临床标本进行培养，得到单菌落后再通过VITEK-MS进行鉴定，效果较好，缩短了传统的表型及生化试验需要的鉴定时间，但大多数情况下转种培养基分离菌落仍需要18～24 h的培养时间，未能在24 h内向临床提供鉴定结果，并增加了临床患者治疗风险和医疗负担。而本次实验采用不分纯菌落直接抽取样本鉴定的方法，从预处理单个标本到得到鉴定结果约为2 h，大大缩短了现行分纯菌落再鉴定的方法所需的时间。

实验研究的原始的临床标本包括血液、胸腹水、胆汁、脓液等[5]，并在报阳后的12 h内完成检测，确保细菌有足够的活力和浓度。本研究中革兰阳性球菌比革兰阴性杆菌更易用VITEK-MS直接鉴定[6-7]，但因革兰阳性球菌的样本量较少，仅为10例，可能不具有代表性。结果显示大肠埃希菌较肺炎克雷伯菌的鉴定效果为差，两者均为革兰阴性杆菌，形态特征较为相似，其鉴定结果的差异是何种原因引起仍需要进一步研究。

根据表1的两种鉴定方法所得的结果对比，直接鉴定的阳性率略微偏低，但临床符合率较好，达到80%以上，即能够鉴定出来的细菌绝大部分为临床标本中的致病菌，对于快速、正确指导临床用药、减轻医疗负担有重要意义。直接鉴定的阳性率和临床符合率还有进一步提升的空间，表现为：①直接鉴定前期属于新方法学的探索期，新的鉴定方法流程尚未完善，也无统一的处理标准[1]，不同实验室鉴定结果较大[9-10]；②裂解细胞用的皂素为自行配制，实验中每周配制一次，但保质期和最佳使用时效未知；③重悬过程不充分可能使反应裂解不完全，提取不到足够量的细菌蛋白； ④全自动培养仪报告假阳性，而培养瓶并无细菌生长，在报阳的50例培养瓶中就有3例两种鉴定结果均为阴性，为提高阳性率可以通过革兰快速染色镜检确认有无细菌，再进行进一步鉴定。

本次实验发现了现阶段利用VITEK-MS直接对报告阳性的临床培养瓶标本进行鉴定还存在的问题，比如室间重复性差异较大，鉴定流程尚未完善无统一的标准去规范，对混合菌鉴定能力不足，不同标本类型、培养瓶类型之间的鉴定也存在差异等。但利用VITEK-MS直接检测报告阳性的临床培养瓶标本自动化程度高、高通量，操作简单，对原始的标本的即使是相对分纯菌落再进行质谱鉴定的方法学也有显著的时间优势，能把鉴定时间缩短到2 h左右，给在临床细菌感染治疗和减轻医疗负担方面提供了重要的方向。在国外许多临床实验室都在积极推广MS微生物鉴定技术，随着本研究技术的逐渐成熟，该方法将在微生物鉴定的领域有更广阔的应用场景。

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Direct bacterial identification in positive culture bottles by use of the VITEK-MS system

YangLing,MoXiaoyan,ChenDingqiang.

DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China

【Abstract】ObjectiveTo find a fast method for detection of pathogens in positive culture bottles by using the VITEK-MS system.MethodsVITEK-MS microbial identification system was used to directly identify the bacteria in the positive culture bottles, without culture on agar plates. The identification results were further compared with those by the traditional biochemical identification.ResultsForty-seven bacterial strains were identified by traditional biochemical methods among 50 positive culture bottles, and 3 of them were negative. Of these 50 samples, thirty-one bacterial strains were identified by VITEK-MS and 3 were also negative. The sensitivity and specificity for direct VITEK-MS identification were 65.96% and 100%, and the clinical coincidence rate was 68%. The turn around time for identification was reduced from 24 to 2 hours.ConclusionDirect identification of bacterial pathogens in positive culture bottles by VITEK-MS could reduce turn around time, and lead to accurate and fast diagnosis.

【Key words】VITEK-MS; Positive culture; Direct identification

基金项目：广州市医药卫生科技项目(20161A011064);国家自然科学基金项目(81201341)

通信作者：陈定强，E-mail：jyksys@126.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.03.004

(收稿日期：2015-12-23)