HPLC法测定牛磺熊去氧胆酸胶囊的有关物质

刘小双蒲旭峰欧世荣杨 蕊（ 成都中医药大学药学院，四川 成都 637， 成都欣捷高新技术开发有限公司，四川 成都 6004）



HPLC法测定牛磺熊去氧胆酸胶囊的有关物质

刘小双1蒲旭峰1欧世荣2杨 蕊2
（1 成都中医药大学药学院，四川 成都 611137，2 成都欣捷高新技术开发有限公司，四川 成都 610041）

【摘要】目的 建立测定牛磺熊去氧胆酸胶囊有关物质的方法。方法 采用KromasilC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH至3.0），梯度洗脱，检测波长205 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量50 μL。结果 牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸分别在0.048～9.52 µg/mL（r=0.9992）、0.051～101.00 µg/mL（r=0.9998）、2.51～50.28 µg/mL （r=0.9998）范围内与峰面积呈良好的线性关系，其定量限分别为2.489、3.671、126.597 ng；检测限分别为0.702、1.018、38.219 ng。牛磺鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸平均回收率分别为102.12%、99.71%，RSD分别为0.96%、0.62%（n=9）。结论 该方法简便准确、精密度和重复性良好，结果准确可靠。

【关键词】牛磺熊去氧胆酸胶囊；有关物质；高效液相色谱法

牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholicacid，TUDCA）化学名是2-[[（3，5，7）-3α，7β-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物[1]，其具有溶解胆固醇结石和保护肝细胞等生理功能。牛磺熊去氧胆酸胶囊（商品名滔罗特）由BruschettiniS..r.I.（意大利贝司迪大药厂）研制，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化等[2-5]。牛磺熊去氧胆酸胶囊在国内外的药典中尚未见收载，现采用HPLC测定牛磺熊去氧胆酸胶囊中的已知杂质牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholicacid，TCDCA）和熊去氧胆酸（ursodeoxycholicacid，UDCA）及其他有关物质，报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器：Agilent1200高效液相色谱仪（G1315A型DAD检测器）。

1.2 试药：牛磺熊去氧胆酸钠对照品（购自美国TRC公司，批号T009200，含量99.7%），牛磺鹅去氧胆酸对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号110846-200506，含量99.2%），熊去氧胆酸对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号110755-9003，含量97.6%），甲醇、乙腈均为色谱纯（Sigma公司），水为超纯水；其他试剂试药均为分析纯；市售滔罗特牛磺熊去氧胆酸胶囊（批号0907、1165）均由成都欣捷高新技术开发有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸钠对照品10.51 mg、牛磺鹅去氧胆酸对照品15.18 mg、熊去氧胆酸对照品15.40 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1.0 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备取牛磺熊去氧胆酸胶囊内容物，混匀，研细，精密称取适量（约相当于牛磺熊去氧胆酸100 mg），置于20 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声提取5 min，放冷至室温，再加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.2 色谱条件与系统适用性：试验采用KromasilC18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH至3.0），梯度洗脱（0 min，20%A；15 min，35%A；30 min，20%A）；柱温：30 ℃；检测波长：205 nm，流速1.0 mL/min，进样量50 μL。在上述色谱条件下，取混合对照溶液进样测定，记录色谱图（图1）。结果显示各杂质峰及杂质与主成分峰之间分离度均＞1.5，符合要求。

图1 牛磺熊去氧胆酸有关物质系统适应性分离图

2.3 专属性考察：将经酸、碱、氧化、高温、高湿及光照破坏的供试品溶液按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图（图2）。结果表明：供试品溶液在各破坏试验条件下均有不同程度的降解，各降解杂质基本能被检出，且各杂质峰间及杂质峰与主峰间均能达到基线分离，表明本方法专属性较好。

图2 牛磺熊去氧胆酸胶囊专属性试验色谱图

2.4 线性关系：精密称取牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸对照品适量，分别用甲醇溶解成一系列浓度标准溶液（牛磺熊去氧胆酸：0.048、0.48、2.38、4.76、5.71、9.52 µg/mL；牛磺鹅去氧胆酸：0.051、5.05、25.25、50.50、60.60、101.00 µg/mL；熊去氧胆酸：2.51、12.57、25.14、30.17、50.28 µg/mL），精密量取上述溶液各50 μL，分别注入色谱仪。以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），所得线性回归方程（n=6）及线性范围见表1。

2.5 定量检测：限取2.4项下的对照品溶液，加甲醇逐级稀释，进样测定，测得各化合物的定量限及检测限见表1。

2.6 重复性：精密量取2.1项下方法制得供试品溶液和对照品溶液，平行操作6份，进样测定，记录峰面积计算RSD值，牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸含量RSD分别为1.44%、1.62%、1.98%，其他最大单杂含量RSD=1.67%，总杂含量RSD=1.03%。

2.7 稳定性：取对照品溶液和批号为1165的供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、8、24、48 h进样测定，在48 h内供试品溶液中杂质峰面积未有明显增加，供试品溶液中牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸含量RSD分别为1.39%、0.07%、3.82%，其他最大单杂含量RSD=1.22%，总杂含量RSD=0.88%（n=6）结果表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.8 加样回收率：取2.7项下供试品溶液和对照品溶液进样测定，计算牛磺鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸的含量。另加2.1.1项下混合对照品贮备液适量于供试品溶液中，制得含牛磺鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸7.5、15、22.5 μg/mL的溶液，每个浓度平行3份，牛磺鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸平均回收率分别为102.12%、99.71%，RSD=0.96%、0.62%（n=9）。

2.9 样品测定：分别精密量取50 μL牛磺熊去氧胆酸对照品溶液和供试品溶液，按照2.2项色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见表2。

表2 牛磺熊去氧胆酸胶囊有关物质测定结果

3 讨 论

牛磺酸和熊去氧胆酸为牛磺熊去氧胆酸合成的起始原料，亦为其主要工艺杂质与降解杂质，为控制胶囊质量需对牛磺酸和熊去氧胆酸进行检查。牛磺酸仅有末端的紫外吸收，参考文献[6]采用TLC来检查。采用本文的HPLC色谱条件与文献[7]收录薄层色谱法相比，更能有效的控制熊去氧胆酸的量。参考张晓艳[5]等的研究，将205 nm作为有关物质的检测波长。

参考文献

[1] 王海龙,吴成龙,邓勇等.牛磺熊去氧胆酸的合成[J].中国医药工业杂质,2009,40(2):88-89

[2] 沈俊,周聃,张若丹,等.HPLC测定风热清胶囊中的绿原酸和牛磺熊去氧胆酸[J].华西药学杂志,2008,23(3):346-348.

[3] 骆助林,陈理国,苗建国,等.保胆取石术后口服牛磺熊去氧胆酸预防结石复发的临床观察[J].中国循证医学杂志,2011,11(6): 644-646.

[4] 张晓艳,崔蕊,贾建静,等.HPLC测定牛磺熊去氧胆酸胶囊中的有关物质[J].华西药学杂质,2012,27(5):585-587.

[5] JX20080085,牛磺熊去氧胆酸胶囊(滔罗特)进口标准[S].

[6] 中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].二部,北京:化学工业出版社,2010:1105-1106.

中图分类号：R282.710.5

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）09-0028-02