5%TNBS与乙醇不同剂量配伍优化大鼠UC模型的探索*

贾雪燕　李　舒　张　红　杜晓泉

陕西中医药大学(咸阳712046)



5%TNBS与乙醇不同剂量配伍优化大鼠UC模型的探索*

贾雪燕李舒张红杜晓泉△

陕西中医药大学(咸阳712046)

摘要目的：对比5%TNBS与不同浓度无水乙醇联合液诱导大鼠UC模型的差异，优化大鼠溃疡性结肠炎的造模方法。方法：40只雌性SD大鼠， 随机分为8组，包括1个正常组和7个模型组(n=5)。浓度分别为：模型1组：(5%TNBS 0.25mL+无水乙醇0.25mL)；模型2组：(5%TNBS 0.2mL+无水乙醇0.2mL)；模型3组：(5%TNBS 0.07mL+无水乙醇0.15mL+纯水0.8mL)；模型4组：( 5%TNBS0.3mL+无水乙醇0.2mL)；模型5组：(5%TNBS0.07mL+无水乙醇0.12mL+纯水0.11mL)；模型6组：( 5%TNBS 0.1mL+80%乙醇0.1mL)；模型7组：( 5%TNBS0.09mL+无水乙醇0.06mL)。采用不同配比的混合液对各组大鼠分别进行灌肠，观察各组大鼠的死亡率以及体重的变化。造模10d后取距离肛门8cm处结肠组织进行病理切片。结果：与正常组比较，模型组各组均出现黑便症状以及结肠溃疡的病理改变，模型1、2、3组10的死亡率为100%，模型4组20%，模型5组为80%，模型6组为60%，造模7组没有死亡现象。结论：采用5%TNBS联合乙醇复制大鼠UC模型的最佳配置比例为：5%TNBS 0.09mL和无水乙醇0.06mL。

主题词结肠炎，溃疡性/中西医结合疗法动物实验大鼠

溃疡性结肠炎是一种发病机制尚未阐明的慢性、复发性的炎症性肠病。据流行病学显示近20年UC的发病率与人们的生活水平呈正相关且逐年增高，发病年龄范围也越来越广泛。据统计，亚洲的发病率为1.0/10万～2.0/10万，患病率为4.0/10万～44.3/10万，中国UC患病率为11.6/10万，因此，规范UC的治疗，降低UC的发病率，是当前医务工作者的重要任务[1]。大量临床病历研究显示，中医药治疗UC有显著疗效，在一定程度上大大降低了UC的患病率和复发率。在中医药治疗UC的机理和疗效研究中，动物模型的建立是研究结果真实准确的基础。目前，关于UC的造模动物有SD大鼠、Wistar大鼠、C57小鼠等[2]。造模方法主要有化学诱导模型、免疫法等，如2，4，6—三硝基苯磺酸(TNBS)法、乙酸灌肠、DSS葡聚糖硫酸钠等[3]。其中通过TNBS造模来探讨UC患者活动期症状，研究药物对溃疡性结肠炎患者的治疗作用及机制，为治疗溃疡性结肠炎奠定了理论基础[4]。对于TNBS造模时造模剂的配置剂量，有报道研究，不同剂量的TNBS，对造出溃疡性结肠炎大鼠模型的影响不同[5]，也认识到把握好麻醉及TNBS/乙醇混合液的剂量是降低死亡率，建立持续而稳定的大鼠慢性溃疡性结肠炎模型的关键[6]。迄今关于TNBS/乙醇混合液的最佳配置剂量研究未见报道。本论文通过采用5%TNBS诱导大鼠肠损伤制作溃疡性结肠炎的模型实验，观察大鼠病情变化及肠粘膜的病理变化，旨在寻找5%TNBS与乙醇的最佳造模配置比。

1材料与方法

1.1研究动物清洁级SD雄性大鼠40只(西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：SYXK(陕)2012-003)，体重(180-220g)。

1.2实验器材5%TNBS(美国sigma公司，批号： P2297)，无水乙醇(西安化学试剂厂，批号：130618)，水合氯醛(上海山浦化学有限公司)，生理盐水(石家庄四药有限公司)，一次性使用儿童导尿硅胶管(扬州市桂龙医疗器械有限公司)，固体石蜡(德州默霖消毒科技有限公司)，一次性1mL注射器，PBS，10%甲醛(成都市科龙化工有限公司)。

1.3造模方法除正常组外，模型组参考Karaca[7-8]制备方法采用TNBS诱导的动物模型，将40只SD雌性大鼠随机分成七组，造模组35只，具体浓度和剂量参照表1，正常组5只，仅灌注0.5mL生理盐水。造模前大鼠须禁食不禁水12h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3mL/100g)，在固体石蜡润滑下，用改良后的一次性儿童硅胶导尿管，导入距离肛门约8cm的结肠，导入造模液0.15mL。注意：导入造模液时取头低尾高位，并倒置40s，保证造模液与结肠充分接触，然后将大鼠头低尾高30度体位放置于垫料中5min。造模完后，调整室温至27℃～30℃，直至大鼠自然苏醒。

表1　UC造模浓度和剂量

1.4观察大鼠体重、进食、粪便情况、记录死亡数量分别于大鼠造模前及处死前称量大鼠体重，在造模完成后观察大鼠的体重，进食情况以及有无粘液脓血便的状况。记录各组动物死亡的情况，计算第10天的死亡率。

1.5大鼠结肠组织病理切片HE染色观察将大鼠麻醉，取距离肛门8cm处结肠组织，经PBS清洗后迅速将其投入包埋框，并用10%甲醛固定，浸泡12h，然后进行石蜡组织包埋，切片(厚度为3um)，并HE染色，观察大鼠结肠的变化。

2结果

2.1一般情况实验组大鼠造模后从第一天开始都有活动减少，食欲下降，精神萎靡，便血等症状。两天后出现黑便，大便形状成扁椭圆形，持续至取材当天。正常对照组食欲正常，大便无明显变化，造模后进食水稍多。

2.2大鼠造模前后体重的比较造模前大鼠平均体重为236.6g，造模后大鼠平均体重为274.7g，比较造模前后的体重有所增加，经T检验比较，有显著性差异，P<0.0001。

2.3各组大鼠死亡率的变化七组造模大鼠造模后陆续开始有死亡现象，10天之内，如表2所示，模型1、2、3组10的死亡率为100%，模型4组20%，模型5组为80%，模型6组为60%，造模7组没有死亡现象。解剖死亡大鼠，发现大部分造模组大鼠死亡原因为肠梗阻所致。见表2。

表2　造模后大鼠死亡率的比较

2.4各组结肠组织的病理学变化正常组大鼠结肠表面光滑血管清晰，内壁绒毛整齐规律，可见杯状细胞，无出血和溃疡面。造模1组肠道内壁表面绒毛消失，大量炎性细胞浸润，溃疡深入到肌层。造模2组可见肠道内壁绒毛刷状缘大面积消失，有大量的空泡细胞，黏膜及粘膜下层变薄。造模3组清晰可见黏膜和黏膜下层大量炎性细胞浸润，刷状缘部分消失，部分可见。造模4组可见整齐刷状缘，有少量小溃疡，基底部有少量出血。造模5组明显可见有出血，少量溃疡，刷状缘整齐可见空泡细胞。造模6组肠黏膜隐窝处有小脓肿形成，黏膜及黏膜下层可见中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞浸润，继而有广泛溃疡形成。溃疡底部有时可见急性血管炎，血管壁成纤维素样坏死。造模7组可见明显小溃疡面，肠粘膜隐窝处有小脓肿，黏膜下层可见大量炎性细胞浸润。见图1。

3讨论

溃疡性结肠炎确切的发病机制尚不明确，需要加强研究。关于溃疡性结肠炎发病机制和实验治疗学的研究主要依赖于动物模型，成功复制溃疡性结肠炎动物模型是开展UC发病机制和中西药防治UC 的关键。常见的动物模型有C57小鼠，SD大鼠等。TNBS灌肠所复制的动物模型与人类UC病变特点相似，是研究药物治疗效用与机制较好的模型，但是，目前使用TNBS诱导大鼠溃疡性结肠炎的浓度以及与无水乙醇的比例存在多种方案，尚无确切数值，造模的成功率不够稳定。研究发现，造模剂的浓度是制约模型成功的关键因素，因此，急需探索TNBS与无水乙醇联合的合适比例，优化大鼠溃疡性结肠炎的造模方法。本实验摸索出采用TNBS结合乙醇造模的最佳实验条件：浓度比例为5%TNBS 0.09mL与无水乙醇0.06mL，实验室温度必须保持在27℃～30℃以保证大鼠的体温，麻醉剂量为10%水合氯醛0.3mL/100g。此种造模比例最为经济有效，周期短，方法简单，是研究溃疡性结肠炎发病机制和有关中医药疗效观察的理想模型。

图1　七组造模大鼠与正常组大鼠结肠组织HE染色的比较(×100)

综合我们的实验结果，提示 采用5%TNBS结合乙醇造UC大鼠模型的最佳配置比例为：5%TNBS 0.09mL和无水乙醇0.06mL。这种比例造出的溃疡性结肠炎模型不仅有黑便、腹泻、精神倦怠等溃疡性结肠炎的症状，而且死亡率小，病理组织切片也符合溃疡性结肠炎的表现，值得应用。

参考文献

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[2]李茹柳，迟莉，郭文峰，等．造模因素对TNBS致大鼠溃疡性结肠炎模型的影响[J] ．中药药理与临床，2007，23(6)：81-83．

[3]孙载鑫，李欣，武喜健．UC模型大鼠造模方法建立和探讨[J] ．齐齐哈尔医学院学报，2015，36(12)：1717-1719．

[4]吴小庚，王爱磊，张学明，等.实验性溃疡性结肠炎大鼠模型的建立 [J] ．河北医药，2011，33(4)：493-495．

[5]张冰冰，齐越，贾冬，等。2，4，6-三硝基苯磺酸诱导溃疡性结肠大鼠模型的建立及评价[J].中华中医药学刊，2015，33(8)：835-836.

[6]惠毅，闫曙光，李京涛，等．大鼠慢性溃疡性结肠炎模型建立方法探讨[J] ．辽宁中医药大学学报，2013，15(10)：62-65．

[7]Karaca T， Uz Y H， Demirtas S， et al. Protective effect of royal jelly in 2， 4， 6 trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in rats[J]. Iranian Journal of Basic Medical Sciences， 2015， 18(4)： 370.

[8]Yoon S W， Lee C H， Kim J Y， et al. Lactobacillus casei secreting alpha-MSH induces the therapeutic effect on DSS-induced acute colitis in Balb/c Mice[J]. Journal of microbiology and biotechnology， 2008， 18(12)： 1975-1983.

(收稿2016-001-12；修回2016-02-23)

5% TNBS coordinate with different doses of ethanol to optimize the model of UC in rats

ShaanxiUniversity of Chinese Medicine(Xianyang712046)

Jia XueyanLi ShuZhang Honget al

ABSTRACTObjective： To compare the difference of 5% TNBS joint different concentrations of ethanol to induce UC model in rats，and optimize the methods inducing UC. Methods:40 female SD rats were randomly divided into eight groups， including a control group and seven model group (n=5). The ethanol concentrations were shown as following： Model 1 group： (5% TNBS 0.25mL+ ethanol 0.25mL); model 2 groups： (5% TNBS 0.2mL + ethanol 0.2mL); Model 3 groups： (5% TNBS 0.07mL + dry Ethanol 0.15mL + water 0.8mL); Model 4 group with 0.3mL 5% TNBS and 0.2mL ethanol， model 5 groups with 0.07mL 5% TNBS and pure water and ethanol 0.11mL 0.12mL， model six groups with 0.1mL5 % TNBS and 80% ethanol 0.1mL， model 7 groups with 0.09mL5% TNBS and ethanol 0.06mL. A mixture of different proportions of each group were lavaged. After modeling 10d， mortality and changes in body weight of the rats were observed. and colon tissue at 8 cm from the anus were taken for morphology. Results： Compared with normal group， melena symptoms and pathological changes of the colon ulcers were found in each model group.l Mortality were 100% in No. 1，2，3 groups ，20% in No. 4 group， 80% in No. 5 group and 60% in No. 6 group， but no mortality in No. 7 groups. Conclusion： The optimal allocation of TNBS and ethanol for rat model of UC is 5% TNBS 0.09mL and ethanol 0.06mL.

KEY WORDSColitis，Ulcerative/Traditional Chinese medicine therapyAnimal ExperimentationRats

通讯作者△

【中图分类号】R574.1

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.081

*陕西省科学技术研究发展计划 (2013K12-01-20)