橡胶树肌动蛋白解聚因子的表达和功能鉴定

邓治，刘向红,2，李德军*

(1.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737；2.海南大学农学院，海南 海口 570228)



橡胶树肌动蛋白解聚因子的表达和功能鉴定

邓治1，刘向红1,2，李德军1*

(1.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737；2.海南大学农学院，海南 海口 570228)

摘 要：为探寻肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor, ADF)在调控肌动蛋白解聚和聚合平衡过程中发挥的作用，从橡胶树中获得了HbADF基因组序列，经测定，该序列长2 258 bp，含有2个内含子和3个外显子，在裂殖酵母中过表达HbADF，获得相对分子质量约38 000的融合蛋白。对裂殖酵母细胞形态进行观察，发现诱导表达HbADF的酵母细胞长度显著增加，双核和多核比例达67%。实时荧光定量PCR结果表明，HbADF的表达受3% KI处理调控，在橡胶树不同死皮阶段和不同排胶时间段的表达存在变化，说明HbADF可能参与了橡胶树排胶和死皮的过程。

关 键 词：橡胶树；肌动蛋白解聚因子；表达分析；功能鉴定；排胶；细胞形态

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肌动蛋白(actin)是真核生物细胞中普遍存在的一种高度保守的重要蛋白质，它是细胞微丝骨架的主要组分。微丝骨架在真核生物中参与许多重要的生理活动，如细胞形态控制、胞质运动、防御反应、胞内运输、细胞信号传导和重力感应等[1–7]。肌动蛋白聚合与解聚的动态变化是微丝骨架实现其功能的关键。该过程由大量的肌动蛋白结合蛋白通过精密的调节来实现。广泛存在于真核生物中的肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor, ADF)作为肌动蛋白结合蛋白的重要成员，在调节肌动蛋白聚合与解聚平衡过程中发挥重要作用。ADF基因在植物中参与多种生理过程，如细胞生长和分化调控过程[8–9]、顶端生长过程[10–12]、生根过程[13]、冷驯化过程[14]、植物抗病过程[15–18]等。

巴西橡胶树 (Hevea brasiliensis)原产于亚马逊河流域，是天然橡胶的唯一商业来源。排胶时间是限制天然橡胶产量的关键因素之一。乳管伤口堵塞是决定排胶时间的主要因子[19]。割胶后，乳管伤口末端形成一个蛋白质网状结构，它在乳管堵塞过程中起重要作用[19–20]。高正权等[21]采用TRITC–Phalloidin对树皮样品的石蜡切片进行染色，观察到排胶过程中F–actin在乳管伤口末端逐渐聚集。采用免疫印迹法进行分析，发现割胶后采集的胶乳中肌动蛋白含量存在着规律性变化，最先收集的胶乳中肌动蛋白含量高，随后逐渐降低，停排前含量最低，复割时肌动蛋白含量又恢复到较高水平。乳管伤口蛋白质网的形成与肌动蛋白丝的聚集同时发生。Hao等[20]在割胶后立即采集的树皮样品中未发现蛋白质网，割胶后5 min在树皮样品中可观察到稀疏的蛋白质纤维，随着排胶时间的延长，蛋白质网越来越明显。以上研究结果表明，肌动蛋白在橡胶树排胶过程中逐渐被截留在乳管伤口末端，参与形成以微丝为骨架的蛋白质网，使乳管伤口尽快堵塞和愈合，最后使橡胶树停止排胶。橡胶树ADF作为肌动蛋白结合蛋白的重要成员，可能通过调节肌动蛋白解聚和聚合来控制肌动蛋白细胞骨架的动态装配过程，藉此在乳管的堵塞过程中发挥作用。本研究中克隆了HbADF基因组序列，对各处理条件下HbADF的表达模式进行了分析，观察了过表达HbADF的裂殖酵母细胞形态和细胞核，旨在为进一步分析HbADF的调控机制和功能提供参考依据。

1　材料和方法

1.1材料

橡胶树样品均采自中国热带农业科学院试验农场。以1997年定植的橡胶树品系PR107为试验树，采集不同死皮等级橡胶树胶乳样品。选用2007年定植的未开割热研7–33–97幼树，用3% KI对割面上下2 cm进行处理，处理0、6、24、48 h后采集胶乳，以不作任何处理的未开割幼树为对照。以3年割龄的热研7–33–97为材料，割胶后分3次采集胶乳 (于割胶后0～5、>5～35、>35 min采集，分别记为T1、T2、T3)，2 d后复割，复割后0～5 min 再次采集胶乳(记为T4)。

2×Taq PCR Master Mix聚合酶购自北京天根公司，PyrobestTMDNA聚合酶、DNase I、克隆载体pMD18–T和DNA Markers等购自大连宝生物公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒购自Thermo Scientific公司。小量酵母细胞完全转化试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。质粒pESP–2、大肠杆菌DH5α和裂殖酵母SPQ–01为农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室保存。引物合成和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2方法

1.2.1橡胶树DNA和RNA的提取

橡胶树叶片基因组DNA提取参照文献[22]中的方法进行。橡胶树胶乳RNA提取参照文献[23]中的方法进行。用DNase I去除RNA中残留的DNA。cDNA第一链合成参照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。

1.2.2巴西橡胶树HbADF基因组序列的克隆与分析

根据已知HbADF全长cDNA序列 (GenBank登录号HM126477)设计基因组扩增特异引物HbADFGF (5′–CTCTCTGCGGCTACTGTATC–3′)和HbADFGR (5′–TCCTGCTTCACCATCCCACA–3′)，以橡胶树基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。将PCR产物回收纯化后与pMD18–T载体进行连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将鉴定为阳性的克隆送公司测序。利用NCBI网站bl2seq在线工具对HbADF全长cDNA和基因组序列进行比对，确定HbADF内含子和外显子。

1.2.3 HbADF的表达分析

采用real-time PCR对HbADF的表达模式进行分析。根据HbADF的cDNA序列设计特异引物HbADF–qRTF(5′–GCCGTGCCAGCTGAATGTGA–3′)和HbADF–qRTR(5′–TCCTGCTTCACCATCCCA CA–3′)，以cDNA为模板进行扩增。同时以橡胶树18S rRNA基因为内参，设计引物Hb18S–qRTF (5′–GCTCGAAGACGATCAGATACC–3′)和Hb18S–qRTR(5′–TTCAGCCTTGCGACCATAC–3′)对各处理模板进行扩增。相对表达量用2–ΔΔCt法计算。采用SPSS 19统计软件进行数据分析。

1.2.4HbADF真核表达载体的构建

根据HbADF的cDNA序列和真核表达载体pESP–2多克隆位点设计引物HbADFOF (5′–GGATCCATGGCCAATGCTGCTTCTGG–3′，下划线表示BamHI识别序列)和HbADFOR (5′–GCATGCTCAG CTGGCACGGCTTTTAAA–3′，下划线表示Sph I识别序列)，以橡胶树胶乳cDNA为模板扩增HbADF开放阅读框。将扩增产物回收后连接至pMD18–T载体，挑取阳性克隆送公司测序。用BamH I和Sph I对质粒进行双酶切，回收目的条带，通过T4DNA连接酶与经同样双酶切回收的载体pESP–2进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，提取质粒，用BamH I和Sph I进行双酶切及菌落PCR鉴定。

1.2.5HbADF在裂殖酵母中过表达的分析

参照试剂盒说明书，将验证正确的重组质粒转化裂殖酵母SPQ–01感受态细胞，将转化菌液涂布在含有5 μmol/L硫胺素的EMM培养基上，30 ℃培养3～5 d。挑取酵母单克隆于含5 μmol/L硫胺素的EMM液体培养基中30 ℃培养2 d。按1∶100比例取菌液至新鲜的含5 μmol/L硫胺素的EMM液体培养基中，30 ℃继续培养至OD600 nm为0.2左右。将培养物均分为2份，离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体3次。将菌体分别接种于不含硫胺素和含5 μmol/L硫胺素的EMM液体培养基中，30 ℃摇菌诱导20 h。提取诱导表达的融合蛋白进行SDS–PAGE电泳，同时以pESP–2空载体转化酵母为负对照，以细胞松弛素B处理裂殖酵母SPQ–01为正对照。

1.2.6过表达HbADF裂殖酵母形态和细胞核的观察

取10 μL上述培养物置于载玻片上，盖上盖玻片，油镜下观察细胞形态。为观察细胞核数目，取20 μL培养物，用50 mmol/L PBS (pH6.8)洗3次，加入终质量浓度为5 μg/mL的4',6–二脒基–2–苯基吲哚 (DAPI)，每个处理均随机选择50个酵母细胞，测量其长度和宽度。每个处理随机选择100个DAPI染色的酵母细胞，观察其双核或多核比例。采用SPSS 19软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1HbADF基因组序列及基因结构

以橡胶树品系热研7–33–97基因组DNA为模板，通过PCR和测序技术，获得2 258 bp的HbADF基因组序列。比对HbADF基因组序列和全长cDNA序列，发现获得的HbADF基因组序列包括完整的开放阅读框和部分5′、3′–UTR序列 (图1)。HbADF基因组序列含有2个内含子和3个外显子。2个内含子的大小分别为1 604、94 bp，依次位于DNA序列 (以起始密码子ATG中A为第1位)的4～1607位和1874～1967位，所有内含子与外显子剪接处均符合GT/AG模式。第1个内含子插入在HbADF编码氨基酸序列起始密码子的第3个碱基与第2位Ala的第1个碱基之间，第2个内含子插入在HbADF编码氨基酸序列第80位Trp的第2个碱基与第3个碱基之间。

图1　HbADF基因组序列Fig.1 Genomic sequence of HbADF

2.2HbADF的表达模式

以Hb18S rRNA为内参，采用real-time PCR方法分析HbADF表达模式。与健康橡胶树相比，死皮树胶乳中HbADF的表达量下降，其中5级死皮树胶乳中HbADF的表达量最低，约为健康树胶乳中表达量的58%(图2)。KI处理调控HbADF表达，处理后24 h的表达量达到最高，约为处理后0 h表达量的3.18倍，随后降低 (图3)。不同排胶时间下HbADF的表达结果显示，随着排胶时间的延长，HbADF的表达量逐渐下降，割胶35 min后至停排时间段收集的胶乳中，HbADF的表达量仅为割胶后0～5 min胶乳的72 %左右，复割后0～5 min胶乳中HbADF的表达量上升 (图4)。

图2　不同死皮等级橡胶树胶乳中HbADF的相对表达量Fig.2 Expression patterns of HbADF in latex from different

图3　不同KI处理时间HbADF的相对表达量Fig.3 Expression patterns of HbADF under KI treatment

图4　不同排胶时间HbADF的相对表达量Fig.4 Expression patterns of HbADF under different time of latex flow

2.3pESP–2–HbADF真核表达载体的构建及其

在裂殖酵母中的过表达

以橡胶树胶乳cDNA 为模板， 扩增出1条约430 bp的条带，回收目的条带，与pMD18–T 载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。提取测序正确的阳性克隆质粒，用BamH I 和Sph I进行双酶切，回收430 bp左右的目的条带，进一步与经同样双酶切并回收的pESP–2载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，进行PCR鉴定。挑取阳性克隆提取质粒，经双酶切后产生约420 bp的目的条带，表明HbADF 编码区已插入真核表达载体pESP–2中。将重组质粒命名为pESP–2– HbADF。

将重组质粒pESP–2–HbADF转入到裂殖酵母SPQ–01感受态细胞后，挑取单克隆菌落进行诱导表达，表达产物经SDS–PAGE 电泳，结果表明诱导表达的pESP–2–HbADF产物中比对照多出了1条相对分子质量约38 000的蛋白条带，其大小与预期pESP–2–HbADF融合表达产物的基本一致。在诱导表达的pESP–2产物中和5 μmol/L硫胺素抑制表达的pESP–2、pESP–2–HbADF产物中均未见该蛋白条带，说明pESP–2–HbADF已在裂殖酵母中成功表达 (图5)。

图5　pESP–2–HbADF/SPQ–01真核表达产物的SDS–PAGE分析结果Fig.5 SDS–PAGE analysis of expression products from yeast SPQ–01 with pESP–2–HbADF

2.4过表达HbADF的裂殖酵母形态和细胞核观察结果

诱导表达HbADF的酵母细胞比未诱导表达HbADF的酵母细胞长，明显比诱导和非诱导条件下转化pESP–2空载体的酵母细胞大，与细胞松弛素B处理的正对照细胞长度的差异无统计学意义，过表达HbADF的酵母细胞宽度与未诱导表达HbADF的酵母、正对照和负对照的酵母无明显差异。DAPI染色结果显示，诱导HbADF过表达的酵母中双核及多核比例为67%，明显比未诱导表达HbADF的酵母，以及诱导或非诱导条件下转化pESP–2空载体负对照酵母中的高，但低于细胞松弛素B处理的正对照细胞(表1)。

表1　各处理酵母细胞的形态指标Table　1 Changes of yeast cell morphology from various treatments

3　结论与讨论

对ADF家族而言，不同物种ADF在内含子数量和位置上相对保守。12个拟南芥ADF家族成员中有10个ADF具有2个内含子和3个外显子，5 个ADF起始密码子后紧接着第1内含子[24]。据研究，矮牵牛PhADF1第1个内含子在拟南芥中可以增强GUS基因表达[25]，该内含子介导的增强反应在进化过程中相对保守[26]。本研究结果表明，HbADF的结构与大多数拟南芥ADF的结构类似，具有2个内含子和3个外显子，起始密码子后紧接着第1内含子。基于ADF第1内含子的保守功能，克隆HbADF基因组序列有助于后续的基因表达调控研究。

割胶后乳管伤口末端形成的蛋白质网在乳管堵塞过程中起着关键作用，该蛋白质网的形成与肌动蛋白丝的聚集同时发生[21]。邓顺楠[27]推测“蛋白质网”通过与肌动蛋白互作，把堵塞物固定在乳管伤口末端。作为肌动蛋白结合蛋白重要成员的ADF，通过解聚与聚合肌动蛋白来调节肌动蛋白细胞骨架的动态装配过程，藉以完成多种细胞功能。死皮树割线乳管局部或完全堵塞，排胶量明显下降，甚至停止排胶。不同死皮阶段橡胶树胶乳中HbADF的表达量都低于健康树，5级死皮树胶乳中的HbADF表达量仅为健康树的58%。死皮树中HbADF下调可能引起F–actin解聚减少，胶乳中F/G–actin比例增大，易于形成蛋白质网堵塞乳管。KI作为微丝解聚剂能使F–actin解聚，高浓度KI引起橡胶树死皮[21]。本研究中发现KI调控HbADF表达，可推测HbADF可能参与了KI 解聚F–actin的过程，但还需进行进一步试验加以证明。在排胶过程中，乳管排出的胶乳中肌动蛋白含量逐渐减少，这与肌动蛋白微丝在乳管伤口的聚集现象一致，表明胶乳中的肌动蛋白可能在排胶过程中被截留在乳管伤口[21]。本研究中发现，随着排胶时间的延长，HbADF的表达量逐渐下降，这可能引起乳管中F/G–actin比例增大，蛋白质网逐渐形成，乳管排出的胶乳中肌动蛋白含量逐渐减少，而未排出乳管的肌动蛋白直接被截留在乳管伤口末端的蛋白质网上。本研究结果与文献[21]的研究结果一致。结合本项目组的前期研究结果 (HbADF受乙烯和茉莉酸调控[28]，乙烯在橡胶树死皮和排胶过程扮演重要角色。)进行分析，可推测HbADF可能参与了橡胶树死皮和排胶的过程。

在裂殖酵母中过表达植物ADF能引起肌动蛋白弥散和双核现象[29]。在酵母中过表达棉花GhADF7[11]和烟草TaADF7[18]均引起酵母细胞变长。在裂殖酵母中过表达HbADF，酵母细胞明显变长，其宽度没有明显变化，双核和多核比例增大。裂殖酵母细胞于细胞分裂中期在赤道板形成收缩环，在细胞分裂后期，肌动蛋白环启动细胞收缩，将细胞一分为二。裂殖酵母细胞中异源过表达HbADF可能影响肌动蛋白环的形成，抑制中央细胞壁内陷，影响正常细胞分裂，导致多核细胞形成。HbADF过表达可能影响肌动蛋白解聚和聚合平衡，改变肌动蛋白循环速率，最终导致转化酵母细胞中肌动蛋白的结构发生变化，使细胞形态发生改变。

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责任编辑：王赛群英文编辑：王 库

Expression analysis and functional characterization of an actin depolymerizing factor in Hevea brasiliensis

Deng Zhi1, Liu Xianghong1,2, Li Dejun1*
(1.Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2.College of Agriculture, Hainan University, Haikou, 570228, China)

Abstract:Actin depolymerizing factor (ADF) plays an important role in regulating actin assembly and disassembly for cells. In this study, the genomic sequence of HbADF, a 2 258 bp-length with two introns and three exons, was obtained from Hevea brasiliensis with PCR and sequencing methods. The recombinant protein with relative molecular mass about 38 000 was successfully induced by overexpressing HbADF in fission yeast. The cell morphology and the proportion of binucleate or coenocytic cells were further analyzed in the yeast overexpressing HbADF. The results showed that the length of yeast cells from overexpressing HbADF was markedly increased. In addition, it was observed that about 67% of the cells overexpressing HbADF were binucleate or coenocytic after induction. Real-time PCR analysis indicated that HbADF was regulated by 3% KI treatment and its expression varied with tapping panel dryness (TPD) stages and latex flow times. These results suggested that HbADF might play important roles in regulating TPD occurrence and latex flow in Hevea brasiliensis.

Keywords:Hevea brasiliensis; actin depolymerizing factor; expression analysis; function characterization; latex flow; cell morphology

中图分类号：S794.1

文献标志码：A

文章编号：1007−1032(2016)02−0129−07

收稿日期：2015–08–14 修回日期：2016–03–04

基金项目：国家自然科学基金项目(31270651；31200514)

作者简介：邓治(1977—)，女，云南昭通人，硕士，副研究员，主要从事橡胶树分子生物学研究，zizip@163.com；*通信作者，李德军，博士，研究员，主要从事植物分子生物学研究，djli.rricatas@gmail.com