埃博拉病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

曹增国，王化磊，6，盖微微，2，郑学星，6，金宏丽，3，李　岭，2，王丽娜，4，冯　娜，6，赵永坤，6，王铁成，6，高玉伟，6，毕玉海，杨松涛，6*，夏咸柱，6*

(1.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春 130122；2.吉林大学动物医学学院，长春 130062；3.长春西诺生物科技有限公司，长春 130012；4.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；5.中国科学院微生物研究所，北京 100101；6.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009)



埃博拉病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

曹增国1，王化磊1，6，盖微微1，2，郑学星1，6，金宏丽1，3，李岭1，2，王丽娜1，4，冯娜1，6，赵永坤1，6，王铁成1，6，高玉伟1，6，毕玉海5，杨松涛1，6*，夏咸柱1，6*

(1.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春 130122；2.吉林大学动物医学学院，长春 130062；3.长春西诺生物科技有限公司，长春 130012；4.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；5.中国科学院微生物研究所，北京 100101；6.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009)

摘要：为建立EBOV抗体间接ELISA检测方法，以纯化后的EBOV糖蛋白作为包被抗原，HRP标记山羊抗马IgG为二抗，EBOV阳性马血清和阴性马血清分别为阳、阴性对照，优化反应条件，以EBOV病毒样颗粒免疫获得的高免马血清评价其特异性和敏感性，并将检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相比较，进一步评价EBOV抗体ELISA检测方法在EBOV免疫血清抗体水平检测中的应用。优化后的间接ELISA方法可特异性检测EBOV抗体，与西尼罗病毒等的阳性血清均不发生反应，检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相平行。批内、批间试验变异系数均小于8%。本研究成功建立了EBOV抗体间接ELISA检测方法，为EBOV免疫血清抗体水平检测提供了一种简便、快速的检测方法。

关键词：埃博拉病毒；糖蛋白(GP)；间接ELISA；抗体检测

埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)又名埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever，EBHF)，是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的一种人兽共患、急性出血性、烈性传染病[1-3]。人感染埃博拉病毒临床上以高热、出血及高病死率为特征[4]。埃博拉病毒为单股负链、不分节段、有囊膜的RNA病毒[5]，基因组长约19 kb，含有7个结构基因，基因顺序为3′-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5′[5-7]。 2014年，非洲又一次暴发埃博拉病毒病，疫情几乎失控。根据WHO 2015年8月28日发布的最新报告显示，此次疫情全球共28 055人感染EBOV，死亡11 288例，超过以往EVD病死人数总和。形势严峻，已引起世界各国的高度重视。

作为EBOV抗体检测的主要方法，国内外已建立多种ELISA检测方法。但是在建立过程中，抗原的制备大多较为复杂，且鲜有学者使用单独GP作为抗原建立方法。如 M.Saijo等利用重组埃博拉NP蛋白及C端连接的埃博拉与马尔堡病毒(MARV)NP蛋白建立了一种间接ELISA方法，该方法可以特异、敏感地检测到EBOV及MARV的抗体[8]。C.Prehaud等表达了NP蛋白和GP蛋白，并以该2种蛋白建立ELISA方法，结果显示该2种蛋白均能对EBOV-IgG抗体进行检测[9]。

虽然我国目前尚未出现EBOV感染病例，但由于我国与非洲多国存在频繁的贸易及人员往来，且埃博拉疫情的空前严峻，该病传入我国的风险加大。加之我国对外来疫病的防控形势日趋紧迫，急需一批针对外来疫病的诊断方法、治疗体系等作为技术储备，以备不时之需。因此，有必要未雨绸缪，提早进行快速诊断、新型疫苗、特异性抗体等的研发和物质储备。近年来本实验室开展了EBOV病毒样颗粒疫苗和精制抗体的研究。本研究旨在以体外重组表达的GP作为包被抗原，建立一种简便、快速、特异、高通量的EBOV抗体间接ELISA检测方法，并应用于病毒样颗粒疫苗免疫马血清抗体水平的检测，以期用于EBOV血清制剂抗体水平的检测和疫苗免疫效果的评价。

1材料与方法

1.1主要试剂

HRP标记山羊抗马IgG为康为世纪公司产品；封闭液(Blocking ACE)为BIO-RAD公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒为凯基生物公司产品；EBOV阳性马血清、乙型脑炎(JE)阳性马血清、委内瑞拉马脑炎(VEE)阳性马血清、狂犬病(Rabies)阳性马血清、西尼罗病毒病(WNF)阳性马血清、健康阴性马血清、体外重组EBOV糖蛋白均由本实验室制备并保存，TMB显色液为Sigma公司产品。

1.2仪器设备

酶标板购自Corning公司；酶标仪购自BIO-RAD公司。

1.3间接ELISA检测方法的建立

1.3.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 采用方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数。用0.05 mol·L-1碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将纯化的EBOV-GP蛋白稀释成不同浓度，分别按2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-16个梯度包被酶标板(每孔100 μL)，每个梯度包被12个孔。使用封闭液按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀释EBOV阳性及阴性马血清，相同稀释度的阳性及阴性血清加入相邻2列酶标板孔中，最后一行孔用封闭液作为空白对照。其后按照常规间接ELISA方法进行操作。

1.3.2间接ELISA工作条件的优化 对间接ELISA检测方法的其他工作条件进行优化，已确定该方法的最佳工作条件。

1.4间接ELISA检测方法性能评价

1.4.1特异性试验用建立的间接ELISA方法在相同条件下对本实验室保存的日本乙型脑炎病毒(JEV)、狂犬病病毒(RABV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、西尼罗病毒(WNV)阳性血清进行检测，每份样品重复2次，并设立EBOV阴、阳性血清2种对照，用以检测建立的ELISA方法的特异性。

1.4.2敏感性试验将EBOV阴、阳性血清分别按照1∶20～1∶20 480进行倍比稀释，每个稀释度平行做2个重复，用建立的间接ELISA方法进行检测，将检测结果仍能判定为阳性的最大血清稀释倍数作为该血清的效价，评价建立的ELISA方法的敏感性。

1.4.3重复性试验使用同一批次的蛋白质包被酶标板，取阳性、阴性各1份及待检血清3份，采用优化的间接ELISA方法进行检测，并判定批内重复性；以不同批次的蛋白质包被酶标板，取阳性、阴性各1份及待检血清3份，采用优化的间接ELISA方法进行检测，并判定批间重复性。

1.5与基于埃博拉假病毒的中和抗体检测方法的相关性

利用本试验所建立的间接ELISA方法与基于埃博拉假病毒的中和抗体检测方法，分别对本实验室利用EBOV病毒样颗粒疫苗免疫马匹后不同免疫时间点收集制备的马抗血清及未免疫马血清(40份)进行抗体效价检测，并对检测结果进行比较，分析两者的相关性。

2结果

2.1间接ELISA检测方法的建立

2.1.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定以阳性血清OD在1.0左右，阴性血清的OD450 nm值小于0.2，且P/N(阳性/阴性)值最大作为判定标准，来确定抗原最佳工作浓度和血清最佳稀释度。结果显示，抗原包被量为10 μg·mL-1、血清最佳稀释度为1∶160时，P/N值最大。由此确定抗原最佳包被质量浓度为10 μg·mL-1，血清最佳稀释度为1∶160。

2.1.2间接ELISA工作条件的优化经过试验优化，确定的ELISA最佳工作条件：Blocking ACE封闭液37 ℃封闭2 h，待检血清37 ℃孵育1.5 h，HRP标记山羊抗马IgG(康为世纪)1∶20 000稀释，37 ℃孵育1 h，TMB 100 μL·孔-1，室温避光显色30 min，每孔50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4终止显色。

2.2间接ELISA检测方法性能评价

2.2.1特异性试验 间接ELISA检测方法的特异性试验结果表明，JEV、RABV、VEEV、WNV阳性血清和EBOV阴性血清检测结果均为阴性；EBOV阳性血清结果为阳性，由此可得，该间接ELISA方法特异性良好(表1)。

2.2.2敏感性试验用建立的间接ELISA方法检测EBOV阴、阳性血清，当血清稀释至1∶10 240时，检测结果仍为阳性，表明该方法具有较好的敏感性。

2.2.3重复性试验使用同一批次及不同批次的蛋白包被酶标板检测待检样品及阴、阳性血清，批内及批间变异系数均小于8%，所建立的ELISA方法在批内、批间对相同样品间的检测差异不显著，表明该方法具有良好的批内重复性及批间重复性。

2.3高免血清抗体效价检测

利用所建立的间接ELISA检测方法对EBOV病毒样颗粒免疫马血清及未免疫马血清进行抗体效价检测，同时与基于埃博拉假病毒的中和抗体检测结果进行比较，结果显示：对于40份未免疫马血清，二种方法的检测结果均呈阴性；EBOV病毒样颗粒疫苗免疫组马匹随免疫次数的增加间接ELISA效价及基于假病毒的中和抗体效价均呈递增趋势。经过5次免疫后，间接ELISA效价均达到1∶5 120以上，最高可达1∶10 240；基于假病毒的中和试验效价均达到1:10 240以上，最高可达1:20 480。且从效价上升趋势分析，二者趋势具有较高的符合率。免疫后马匹血清抗体检测结果见图1。

图1　间接ELISA与基于假病毒的中和试验检测Fig.1　The result of indirect ELISA and neutralization assay based on pseudo-type EBOV

3讨论

目前，埃博拉病毒抗体检测方法主要有血清中和试验、间接免疫荧光(IFA)及ELISA方法[10-11]。IFA和血清中和试验均需要专业人员参与，且对操作人员具有较高要求。EBOV 为生物安全四级病原体，基于实毒的中和试验需在P4级实验室进行，因而限制了其应用[10]。虽然基于假病毒的中和试验消除了在P4实验室操作活毒的过程，更加安全，但该试验仍对操作人员的要求较高，耗时较长，且在细胞水平引入诸多不确定因素。这使间接ELISA方法的优点格外突出：不需要活毒，且无需在细胞水平操作，试验过程简单、耗时相对较短，因而该方法更加安全、简便。

作为血清学检测及疫苗研制的重要靶点蛋白，糖蛋白(GP)通过与受体结合的方式介导病毒进入细胞，因此与细胞入侵过程及细胞毒性密切相关[12]。此外，GP位点具有中和表位，可诱导产生中和抗体，且针对GP的抗体对EBOV可产生攻毒保护能力[5-7，12-14]。虽然GP暴露于病毒表面，但是GP存在保守并疏水的区域[5，12]。另外，C.Prehaud等的研究表明，在所有被EBOV 感染的病人血清中，均可以检测到GP的抗体[9]。综合以上特点，GP作为包被抗原建立ELISA方法进行抗体水平检测具有可行性。

C.Prehaud等的研究结果表明，将纯化的重组蛋白EBOV-GP和EBOV-NP应用于ELISA方法中，可以解决丝状病毒血清学检测中的假阳性问题[9]。本研究借鉴了该经验，使用原核表达系统诱导表达EBOV-GP，且通过基因工程手段在该蛋白C端插入6His标签，随后通过Ni2+柱亲和层析的方法对蛋白质进行纯化以提高其纯度。且本研究所制备的高纯度蛋白质，可以在较短时间内大量制备，进而可以缩短试验周期。

M.Saijo等建立的ELISA方法可以敏感、特异地识别EBOV及MARV抗体。作为ELISA检测方法的包被原，重组表达的EBOV-NP及MARV-NP嵌合蛋白具有良好的抗原性，但该方法无法实现对丝状病毒的鉴别诊断[8]。因此，本研究单独表达EBOV-GP，从而解决了对EBOV的鉴别诊断。

尽管EBOV遗传学上具有稳定性，且目前只有五个亚型被报道，但不能保证纯化的蛋白质和将来可能出现的变种无交叉反应[15]。因此本研究为未对EBOV进行分型诊断。且由于我国尚未有马尔堡病毒等丝状病毒以及黄热病毒等出血热病毒的出现，所以在特异性分析的过程中选用西尼罗病毒(WNV)、乙型脑炎病毒(JEV)等所引起临床症状相对接近的病毒进行分析。虽然结果显示不存在交叉反应性，但在条件允许的情况下，应与其他丝状病毒及出血热病毒进行比较，进一步分析该方法的特异性。

以本研究建立的间接ELISA检测方法和基于假病毒的中和抗体检测方法分别对样本进行抗体水平检测，结果表明两者具有很好的一致性，说明利用原核表达的EBOV-GP与利用假病毒真核表达的GP均具有良好的反应性，并可用于EBOV-IgG抗体的检测。与基于假病毒的中和试验相比，间接ELISA检测方法无需在高等级实验室操作活毒和细胞，且操作简便、省时、高通量，因此可替代中和试验用于抗体水平的快速检测。

参考文献(References)：

[1]林祥梅，韩雪清，王景林.外来动物疫病[M].北京：科学出版社，2014：296-324.

LIN X M，HAN X Q，WANG J L.Exotic animal disease[M].Beijing：Science Press，2014：296-324.(in Chinese)

[2]殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：773-776.

YIN Z，LIU J H.Animal virology[M].Beijing：Science Press，1997：773-776.(in Chinese)

[3]LI H，YING T，YU F，et al.Development of therapeutics for treatment of Ebola virus infection[J].MicrobesInfect，2015，17(2)：109-117.

[4]扈荣良.现代动物病毒学[M].北京：中国农业出版社，2014：1029-1039.

HU R L.Modern animal virology[M].Beijing：China Agriculture Press，2014：1029-1039.(in Chinese)

[5]程颖，刘军，李昱，等.埃博拉病毒病：病原学、致病机制、治疗与疫苗研究进展[J].科学通报，2014，59(30)：2889-2899.

CHENG Y，LIU J，LI Y，et al.Ebola virus disease：virology，pathogenesis，therapy，and vaccines[J].ChineseScienceBulletin，2014，59(30)：2889-2899.(in Chinese)

[6]金宏丽，王化磊，郑学星，等.埃博拉病毒病疫苗研究进展[J].传染病信息，2015，28(2)：70-74.

JIN H L，WANG H L，ZHENG X X，et al.Advances in the development of Ebloa vaccines[J].InfectiousDiseaseInformation，2015，28(2)：70-74.(in Chinese)

[7]郑学星，杨松涛，王化磊，等.埃博拉疫苗研究新进展[J].中国病原生物学杂志，2013，8(7)：652-655.

ZHENG X X，YANG S T，WANG H L，et al.Recent advances in Ebola virus vaccine development[J].JournalofPathogenBiology，2013，8(7)：652-655.(in Chinese)

[8]SAIJO M，NIIKURA M，MORIKAWA S，et al.Enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to Ebola and Marburg viruses using recombinant nucleoproteins[J].JClinMicrobiol，2001，39(1)：1-7.

[9]PREHAUD C，HELLEBRAND E，COUDRIER D，et al.Recombinant Ebola virus nucleoprotein and glycoprotein(Gabon 94 strain) provide new tools for the detection of human infections[J].JGenVirol，1998，79(Pt 11):2565-2572.

[10]乔晋娟，罗俊，危宏平.埃博拉病毒感染的实验室诊断方法研究进展[J].科技导报，2015，33(1)：100-106.

QIAO J J，LUO J，WEI H P.Laboratory diagnosis of Ebola virus disease：A review[J].Science&TechnologyReview，2015，33(1)：100-106.(in Chinese)

[11]MARTIN P，LAUPLAND K B，FROST E H，et al.Laboratory diagnosis of Ebola virus disease[J].IntensiveCareMed，2015，41(5)：895-898.

[12]王颖芳，段广才.埃博拉病毒及其致病性[J].新乡医学院学报，2014，31(11)：877-882.

WANG Y F，DUAN G C.Ebola virus and its pathogenicity[J].JournalofXinxiangMedicalUniversity，2014，31(11)：877-882.(in Chinese)

[13]MANICASSAMY B，WANG J，JIANG H，et al.Comprehensive analysis of ebola virus GP1 in viral entry[J].JVirol，2005，79(8)：4793-4805.

[14]WILLET M，KURUP D，PAPANERI A，et al.Preclinical development of inactivated rabies virus-based polyvalent vaccine against rabies and filoviruses[J].JInfectDis，2015，212(Suppl 2):414-424.

[15]NIIKURA M，IKEGAMI T，SAIJO M，et al.Detection of Ebola viral antigen by enzyme-linked immunosorbent assay using a novel monoclonal antibody to nucleoprotein[J].JClinMicrobiol，2001，39(9)：3267-3271.

(编辑白永平)

Development of an Indirect ELISA for Detecting Ebola Virus Antibody and Its Application

CAO Zeng-guo1，WANG Hua-lei1，6，GAI Wei-wei1，2，ZHENG Xue-xing1，6，JIN Hong-li1，3，LI Ling1，2，WANG Li-na1，4，FENG Na1，6，ZHAO Yong-kun1，6，WANG Tie-cheng1，6，GAO Yu-wei1，6，BI Yu-hai5，YANG Song-tao1，6*，XIA Xian-zhu1，6*

(1.KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl，InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Changchun130122，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity，Changchun130062，China；3.ChangchunSRBiologicalTechnologyCo.，LTD，Changchun130012，China；4.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；5.InstituteofMicrobiology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China；6.JiangsuCo-innorationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonosis，Yangzhou225009，China)

Abstract:An indirect ELISA which can detect EBOV antibody was established using the purified the envelope glycoprotein as coating antigen.We use the HRP labeled antibody as the secondary antibody，the positive and negative horse sera as controls.After the reaction conditions were optimized，we analyzed the specificity，sensitivity of the indirect ELISA using serum of horse which immunized with EBOV virus like particles.For further evaluation of application of the ELISA，the results were compared to the neutralization assay based on pseudo-type EBOV.The indirect ELISA could detect the antibody against EBOV specifically and showed no cross-reaction with the positive sera of West Nile Fever et al.The indirect ELISA also showed high coincidence with the neutralization assay based on pseudo-type EBOV in evaluation of the immune response after immunization.The coefficient of variation of inter-batch and intra-batch duplicative tests was less than 8%.The indirect ELISA was successfully developed.It provides an effective and convenient method to kinetic detection of antibody against EBOV after immunization.

Key words:Ebola virus(EBOV)；envelope glycoprotein(GP)；indirect ELISA；antibody detection

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.027

收稿日期：2015-09-08

基金项目：国家新药创制重大专项(2015ZX09102025)

作者简介：曹增国(1989-)，男，内蒙古莫旗人，硕士生，主要从事分子病毒学研究，E-mail：495876834@qq.com *通信作者：杨松涛，E-mail:yst62041@163.com；夏咸柱，E-mail:xiaxzh@cae.cn

中图分类号：S852.659.5

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)03-0615-05