X射线对人三阴性乳腺癌细胞E-钙黏蛋白基因表达的影响

张 莹， 王 璐， 刘利敏， 张 颖， 石 静， 林 清

(1. 同济大学附属第十人民医院肿瘤放射治疗科，上海 200072； 2. 上海市宝山区中西医结合医院普外科，上海 201999)



·基础研究·

X射线对人三阴性乳腺癌细胞E-钙黏蛋白基因表达的影响

张 莹1， 王 璐1， 刘利敏2， 张 颖1， 石 静1， 林 清1

(1. 同济大学附属第十人民医院肿瘤放射治疗科，上海 200072； 2. 上海市宝山区中西医结合医院普外科，上海 201999)

目的 研究不同剂量X射线照射人三阴性乳腺癌细胞，照射后不同时间点对人三阴性乳腺癌细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)基因表达的影响。方法 用X射线分2.5、5和10Gy 3个吸收剂量组照射体外培养的人三阴性乳腺癌HCC1937细胞和MDA-MB-231细胞，采用荧光实时定量PCR技术检测HCC1937细胞和MDA-MB-231细胞经照射后6、12、24和48h的E-cadherin mRNA表达水平，以未照射组(0h组)为对照。结果 HCC1937细胞和MDA-MB-231细胞E-cadherin mRNA的表达在2.5、5、10Gy X射线照射后，随着时间点的后移呈升高趋势。与未照射组相比，除了HCC1937细胞10Gy照射后6h、2.5Gy和5Gy照射后24h及MDA-MB-231细胞 5Gy 照射后12h外，各时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。HCC1937细胞在2.5Gy和10Gy照射后48h，E-cadherin mRNA的表达呈下降趋势，与未照射组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 较大剂量的X射线整体可上调HCC1937细胞和MDA-MB-231细胞E-cadherin mRNA的表达，可能诱导了肿瘤细胞凋亡；晚期HCC1937细胞E-cadherin mRNA的表达下降，可能与辐射所致HCC1937细胞的放射生物学效应有关。

三阴性乳腺肿瘤； E-钙黏蛋白； HCC1937细胞； MDA-MB-231细胞； X射线； 照射

三阴性乳腺癌(three negative breast cancer， TNBC)是雌激素受体(estrogen receptor， ER)、孕激素受体(progesterone receptor， PR)、原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2， HER2)均阴性表达的乳腺癌亚型，在所有乳腺癌中占15%～26%[1-2]。三阴性乳腺癌的5年复发或远处转移率(30.8%)明显高于非三阴性(18.7%，P<0.05)，三阴性乳腺癌的5年总生存率(78.4%)明显低于非三阴性(88.1%，P<0.05)[3]。由于TNBC分化差、组织学分级高，因此临床上容易发生复发转移，预后不良。目前TNBC尚缺乏特异性的治疗靶点，不能从内分泌治疗及分子靶向治疗中获益，因此寻找有效的治疗靶点是TNBC治疗的关键。研究[4]发现，约70%的原发性乳腺肿瘤中存在E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达减少甚至缺失，E-cadherin下调是上皮间质化的标志，正是由于E-cadherin的功能缺失导致细胞与细胞之间的黏附力下降，促使上皮间质化的发生，进而引起肿瘤转移。本研究探讨X线辐射对E-cadherin mRNA的表达的影响，从而分析放疗对乳腺癌尤其是TNBC的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

HCC1937细胞株和MDA-MB-231细胞株购自中科院上海细胞库，为同济大学附属第十人民医院医院中心实验室常规保存；RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent Kit试剂盒购自TaKaRa公司；SYBR FAST qPCR Master Mix试剂盒购自KAPA公司;E-cadherin引物、内参(β-Actin)引物均由上海华大基因研究所合成。

1.2 细胞培养和照射条件

HCC1937细胞和MDA-MB-231细胞在37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行培养。取处于对数生长期的HCC1937细胞和MDA-MB-231细胞，常温下以直线加速器(Elekta公司，型号： Precise)X射线(能量： 6MV，SSD： 100cm)进行照射，剂量率450cGy/min，吸收剂量分别为2.5、5和10Gy，照射后分别继续培养6、12、24和 48h。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 总RNA提取和cDNA合成 按TRIzol说明书提取细胞总RNA，进行反转录反应合成cDNA，反应条件： 37℃，15min；85℃，5s。

1.3.2 RT-PCR检测 E-cadherin上游引物序列为5′-TGCCAAGTGGGTGGTATAGAGG-3′，下游为5′-CAGTGGGATGGTGGGTGTAAGA-3′，扩增片段长度约126bp。β-Actin上游： 5′-GCACCACACC-TTCTACAATGA-3′；下游： 5′-TGTCACGCACGA-TTTCCC-3′，大小377bp。取2μl 反转录产物作为模板进行RT-PCR检测，程序设置如下： 95℃，3min；95℃，3s；60℃，30s；40个循环。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 RT-PCR法的特异性

熔解度曲线分析显示，目的基因E-cadherin及内参β-Actin的熔解曲线均成单一峰，熔解温度均一，峰形锐利。反应曲线的其他位置未见到波形，结合Tm值分析提示PCR产物为特异性产物，可以进行结果分析(图1)。

图1 熔解度曲线分析PCR产物特异性Fig.1 Melting curve analysis of PCR product specificity

2.2 E-cadherin mRNA相对表达量

以0h组E-cadherinm RNA的表达量为1，E-cadherin基因的相对表达量的结果见表1。与0h组相比，E-cadherinm RNA的表达在2.5、5、10Gy各剂量组(除了HCC1937细胞10Gy照射后6h、2.5Gy和5Gy照射后24h及MDA-MB-231细胞5Gy照射后12h外)照射后均呈升高趋势，但HCC1937细胞在2.5Gy和10Gy照射后48h，E-cadherin mRNA的表达呈下降趋势，见表1～2。

表1 不同剂量X射线照射HCC1937细胞后不同时间点E-cadherin mRNA相对表达量

照射后时间/h2.5Gy5Gy10Gy01.00±0.001.00±0.001.00±0.0061.30±0.09a1.13±0.05a0.85±0.04121.22±0.08a2.27±0.24a0.92±0.01a241.35±0.151.62±0.311.82±0.09a480.67±0.09a0.77±0.120.09±0.03a

表示与0h组相比，aP<0.05

表2 不同剂量X射线照射MDA-MB-231细胞后不同时间点E-cadherin mRNA相对表达量

照射后时间/h2.5Gy5Gy10Gy01.00±0.001.00±0.001.00±0.0060.19±0.03a0.70±0.02a1.47±0.14a121.20±0.23a1.03±0.061.27±0.11a241.18±0.28a1.22±0.17a1.34±0.17a481.25±0.031.36±0.04a1.11±0.13

表示与0h组相比，aP<0.05

3 讨 论

E-cadherin是一种细胞黏附分子，属于钙离子依赖性跨膜糖蛋白，具有维持组织结构的完整性等作用[5]，在肿瘤侵袭转移中发挥重要的作用[4]。研究[6-7]发现，癌细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)时，E-cadherin表达下降或功能缺失，细胞间黏附力下降、极性丢失，向周围组织浸润生长，并可脱离癌灶发生转移。已经有研究[8]表明E-cadherin表达缺失与TNBC容易发生侵袭转移密切相关，E-cadherin在三阴性乳腺癌的发展过程中起着重要作用，可以作为三阴性乳腺癌患者预后的一个重要的独立预测因素。邓淼等[9]研究表明乳腺癌组织中E-cadherin与HER-2、ER及PR呈正相关，因此TNBC中E-cadherin表达缺失达48.7%，远高于其他两种分子分型；因E-cadherin表达缺失，TNBC发生EMT，易通过淋巴道侵袭及向其他脏器转移，临床预后差。

目前，研究主要集中在E-cadherin与TNBC临床病理参数的关系及与TNBC的预后等方面，关于E-cadherin与TNBC治疗方面的研究报道甚少。关于E-cadherin与TNBC治疗的研究有望成为TNBC靶向治疗新的突破口。由于E-cadherin在乳腺癌复发转移中的重要作用，重新恢复E-cadherin的表达能够抑制肿瘤的侵袭转移。目前尚无针对E-cadherin通路的特异性药物来诱导E-cadherin基因的表达，因此在TNBC中系统深入地研究E-cadherin通路，研制特异性上调E-cadherin表达的方法具有积极的意义。

放射治疗是乳腺癌综合治疗重要手段之一，对于X线照射能否上调E-cadherin的表达鲜有报道，乳腺癌在放疗过程中，肿瘤细胞的凋亡和DNA损伤修复是由多基因调控的，其过程复杂，而E-cadherin是否参与了这个复杂的基因调控，或者放疗是否可以影响E-cadherin的表达是非常值得探究的。本研究显示： 与 0h 组相比，E-cadherin mRNA的表达在2.5、5、10Gy X射线照射后的早期呈升高趋势，但HCC1937细胞在晚期呈下降趋势，大部分时间点差异有统计学意义(P<0.05)。本研究显示： 较大剂量的X射线在早期可上调HCC1937细胞和MDA-MB-231细胞E-cadherinm RNA的表达，抑制大部分肿瘤细胞发生EMT，表明放射治疗对于减少TNBC发生EMT确实有效；而在晚期，随着HCC1937细胞凋亡比率的增加，肿瘤细胞为了抗拒射线带来的损伤可能启动部分调控基因来阻抑凋亡的继续发生，通过某种途径使得E-cadherin mRNA的表达得以回落，比如经典的放射生物学4“R”，即细胞的修复，再增殖，再氧化，细胞周期的再分布，并且细胞能在受照后1h就出现亚致死损伤修复及潜在致死性损伤修复，从而可能调动了细胞的DNA损伤修复反应和细胞周期调控，阻抑了部分HCC1937细胞继续凋亡，使部分HCC1937细胞产生辐射抗性(由于观察节点选定于细胞受照射后48h，可能MDA-MB-231细胞尚未表现出上述现象)。因此，可以根据电离辐射对E-cadherin mRNA的表达的影响进一步探讨TNBC患者相对于其他类型的乳腺癌是否更能从放疗中获益，大分割剂量可能更优于常规分割剂量，重新调控二次放疗的间隔时间，从而制定个体化治疗方案。

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Effect of X-ray on E-cadherin gene expression in human triple negative breast cancer cells

ZHANGYing1，WANGLu1，LIULi-min2，ZHANGYing1，SHIJing1，LINQing1

(1. Dept. of Tumor Radiotherapy， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China；2. Dept. General Surgery， Shanghai Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine with Western Medicine， Shanghai 201999， China)

Objective To investigate the effects of different doses of X-ray irradiation on the expression of E-cadherin gene in triple negative breast cancer cells. Methods Human triple negative breast cancer MDA-MB-231 and HCC1937 cells were exposed to X-ray Irradiation at a dose of 2.5， 5 and 10Gy for 6， 12， 24 and 48h， respectively. E-cadherin mRNA expression levels in HCC1937 and MDA-MB-231 cells after irradiation were detected with fluorescence real-time PCR technology. Results E-cadherin mRNA expression levels in HCC1937 and MDA-MB-231 cells after irradiation were raised with exposure time. Except HCC1937 cell 6h after 10Gy， 2.5Gy irradiation and 24h after 5Gy irradiation， MDA- MB-231 cells 12h after 5Gy irradiation， there were significant differences at all time points between irradiation and non-irradiation groups(P<0.05). E-cadherin mRNA expression of HCC1937 cells was decreased 48h after 2.5Gy and 10Gy irradiation， compared with those of the non- irradiation group(P< 0.05). Conclusion High dose of X-rays irradiation may upgrade the expression of E-cadherin mRNA in human HCC1937 and MDA-MB-231cells， resulting in cell apoptosis. The decreased expression of E-cadherin mRNA in HCC1937 cells after long exposure to X-ray irradiation might be associated with the biological effect of radiation.

three negative breast cancer； E-cadherin； HCC1937 cell; MDA-MB-231 cell； X beam； illumination

10.16118/j.1008-0392.2016.05.005

2016-04-11

张 莹(1969—)，女，副主任医师，学士.E-mail： shiyuanzhangying@163.com

林 清.E-mail： linqing.linda@163.com

R 737.9

A

1008-0392(2016)05-0025-04