新型大麻制剂O-1602对急性胰腺炎小鼠肠道免疫及菌群的影响

李 敏， 林思思， 沈 利， 张瑞琴， 李永渝

(1. 同济大学医学院病理生理教研室，消化系统疾病研究所，上海 200092； 2. 遵义医药高等专科学校生理教研室，贵州 遵义 563000；3. 同济大学医学院病原生物教研室，上海 200092)



·基础研究·

新型大麻制剂O-1602对急性胰腺炎小鼠肠道免疫及菌群的影响

李 敏1，2， 林思思1， 沈 利3， 张瑞琴1， 李永渝1

(1. 同济大学医学院病理生理教研室，消化系统疾病研究所，上海 200092； 2. 遵义医药高等专科学校生理教研室，贵州 遵义 563000；
3. 同济大学医学院病原生物教研室，上海 200092)

目的 研究新型大麻制剂O-1602对急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)小鼠肠道免疫及菌群紊乱的干预作用。方法 成年C57/BL6小鼠21只，雌雄各半，随机均分为AP模型组(AP组，n=7)、AP治疗组(AP+ O-1602组，n=7)及正常对照组(control组，n=7)。AP模型组、AP治疗组以雨蛙肽腹腔注射(50μg/kg)复制AP模型，并分别给以腹腔注射药物溶剂或O-1602溶液(10mg/kg)；正常对照组小鼠用相同方式获得等量生理盐水及药物溶剂注射。3组动物均于末次注药3h后麻醉处死，收集其血液、小肠和结肠及肠道Peyer’s结。检测和分析肠道细菌总数和主要类别、Peyer’s结中T淋巴细胞及其亚群的变化；检测血浆淀粉酶及细胞因子IL-10、MCP-1水平的变化。结果 与对照组相比，AP小鼠肠道细菌总数、主要亚群，尤其是大肠杆菌、肠球菌的数量、血浆淀粉酶活性、IL-10 及MCP-1水平都有明显升高(P<0.05 或P<0.01)；新型大麻制剂O-1602可在一定程度上逆转AP时的上述异常变化(P<0.05)。各组肠道Peyer’s结数量无明显差异，但AP小鼠Peyer’s结中CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比较对照组明显降低(AP组P<0.01,AP+O-1602组P<0.05)，CD4+/CD8+较对照组也有所降低，但差异无统计学意义。结论 O-1602对雨蛙肽诱导的小鼠急性胰腺炎具有一定拮抗作用，其机制可能与其促进肠道细菌的清除、调节肠道T淋巴细胞功能、抑制炎症反应等有关。

急性胰腺炎； 大麻制剂O-1602； 肠道菌群； Peyer’s结； T淋巴细胞； 小鼠

急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)是临床上常见疾病，其发病机制目前还不完全清楚。约1/3的AP患者病情会加重而并发全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome， SIRS)及多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome， MODS)[1]。研究[2-3]表明，在AP的病程演变以及继发MODS和SIRS的过程中，促炎细胞因子及炎症介质起了重要作用，而这些变化与肠道屏障功能紊乱密切相关。临床上，针对AP的治疗对策也随着对AP发病机制的深入认识而不断改善。

经典大麻类物质对肠道炎性疾病的治疗已有很多报道，但由于其明显的副作用及成瘾问题使其应用受到限制。新型大麻制剂O-1602是一种G蛋白耦联受体GPR55(G protein-coupled receptor 55)的激动剂，能特异性激活GPR55，而对经典的大麻素受体CB1和CB2无作用，对神经系统的副作用很小。研究[4-6]表明，O-1602可以通过已知的大麻素抗炎机制减轻AP的病变程度，本研究是继之前研究的基础上进一步探索O-1602对AP时肠道免疫功能以及对肠道菌群的影响，为进一步开发应用价值提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年C57/BL6小鼠21只，体质量为18～26g，雌雄各半，购自南京大学实验动物中心。动物在温度为(25±2)℃、湿度(55±5)%的环境下喂养，整个过程给予标准实验饮食。

1.2 主要试剂和仪器

雨蛙肽购自美国Sigma公司；O-1602购自Biotrend公司；淀粉酶试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；ELISA试剂盒购自深圳达科为生物技术公司；Elx800酶标仪购自美国BioTek公司；BD FACSVerse流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 急性胰腺炎小鼠模型复制及分组处理 取C57/BL6小鼠21只，随机均分为3组： 正常对照组(control)、急性胰腺炎组(AP组)，急性胰腺炎+新型大麻制剂O-1602组(AP+O-1602组)。各组小鼠自由饮水条件下禁食12h后接受实验。参照冯佳燕等[5]、Li等[6]介绍的方法，用雨蛙肽腹腔注射复制小鼠AP模型。具体操作方法如下： 给小鼠腹腔注射雨蛙肽(50μg/kg)，每小时1次，连续注射6次。在第1次雨蛙肽注射前0.5h及注射后5h按10ml/kg体质量经腹腔给小鼠注射药物溶剂(AP组)或1mg/ml浓度的新型大麻制剂O-1602(AP+O-1602组)。正常对照组小鼠获得相同次数和剂量的生理盐水及溶剂行腹腔注射。于末次注射后3h麻醉处死小鼠，取肠组织、肠道Peyer’s结及血液。

1.3.2 血浆淀粉酶活性 血液抗凝，4℃，离心半径5cm，4000r/min，离心10min，取上清液。血浆淀粉酶(amylase)活性按照淀粉酶检测试剂盒说明书进行测定。结果以对照组的值为100%，AP组和AP+O-1602组的值分别以占对照组的百分比来表示。

1.3.3 血浆炎症介质水平 用ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书的方法分别检测血浆IL-10和MCP-1水平，结果以pg/ml表示。

1.3.4 肠菌检测 参照文献[7]的方法，在距盲肠上下1cm左右取回肠和结肠各1cm，称取质量，用LB液冲洗肠壁，分别用麦康凯，胆盐-七叶苷-叠氮钠，BBL以及血琼脂平板选择性培养基对大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌及总细菌进行培养，于有氧或厌氧环境下培养48h后进行细菌计数。结果以组织样品中含有的细菌菌落总数(cfu/mg)来表示。

1.3.5 小肠Peyer’s结T淋巴细胞亚群检测 取小肠全段，记录Peyer’s结数量并摘取之，参照文献[7]的方法，用流式细胞仪收集细胞，检测各组小鼠小肠Peyer’s结中CD3+占T淋巴细胞的百分比以及CD4+、CD8+占CD3+T淋巴细胞的百分比，并计算CD4+/CD8+比值。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 血浆淀粉酶活性的变化

血浆淀粉酶的检测结果显示，AP组小鼠血浆淀粉酶活性较正常小鼠的明显升高(P<0.01)；新型大麻制剂O-1602治疗可明显降低血浆胰酶的活性(P<0.05)，见图1。

图1 新型大麻制剂O-1602对AP小鼠血浆淀粉酶活性的影响Fig.1 Effects of O-1602 on amylase level in plasma from mice with AP与对照组相比，**P<0.01；与AP组相比，#P<0.05

2.2 血浆炎症介质水平的变化

与对照组相比，AP组小鼠血浆中的化学趋化因子MCP-1水平明显增高(P<0.01)，见图2A；O-1602治疗组的MCP-1血浆水平虽仍高于正常对照组(P<0.01)，但较AP组的明显降低(P<0.05)。AP组IL-10 高于对照组，与O-1602治疗组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2B。

图2 新型大麻制剂O-1602对AP小鼠血浆炎症介质水平的影响Fig.2 Effects of O-1602 on levels of inflammatory mediators in the plasma of mice with APA： MCP-1水平； B： IL-10水平；与对照组相比，**P<0.01；与AP组相比，#P<0.05

2.3 肠道菌群的变化

与对照组相比，AP组小鼠回肠、结肠中的大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌以及总细菌数都明显增多，其中以大肠杆菌和肠球菌的增多更为明显(P<0.05)。新型大麻制剂O-1602干预后，回肠益生菌双歧杆菌增多，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余各类致病菌或条件致病细菌较AP组都有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明新型大麻制剂O-1602对肠道细菌的影响是有利的，见表1。

表1 新型大麻制剂O-1602对急性胰腺炎小鼠肠道菌群的影响

与对照组相比，*P<0.05

2.4 小肠Peyer’s结T淋巴细胞亚群的改变

流式细胞检测结果显示，与对照组比较，AP组的CD3+T淋巴细胞数量明显减少(P<0.01)，AP+O-1602组也有明显降低(P<0.05)，但较AP组有所提升。将各组CD3+细胞再分类，得到亚群CD4+和CD8+T淋巴细胞所占百分比以及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值。与对照组比较，AP组CD4+T淋巴细胞所占比例明显降低(P<0.01)，AP+O-1602组虽然与对照组相比也有明显降低，但较AP组是有所增高的。CD4+/CD8+比值的变化趋势同CD4+T淋巴细胞变化相似，见图3、表2。提示新型大麻制剂O-1602可一定程度上提高胰腺炎小鼠小肠Peyer’s结CD4+T淋巴细胞，改善肠道免疫功能。

图3 肠道peyer’s CD3+淋巴细胞百分数的变化(流式代表图)Fig.3 Changes of CD3+ T lymphocyte percentage in the intestinal Peyer’s patches from mice with acute pancreatitis(representative figures captured from flow cytometry measurement)A： 对照组；B： AP组；C： AP+O-1602组

表2 肠道Peyer’s T淋巴细胞亚群的变化

与对照组相比，*P<0.05；与对照组相比，**P<0.01

3 讨 论

AP可由多种病因引起，例如胆道梗阻、酒精中毒、高脂血症、高钙血症、创伤，等等。在我国多以各种胆道疾患引起的胆源性胰腺炎为主[8]。因此，AP发病机制复杂，迄今尚未完全阐明。已有的观点认为： 由于病因的作用，使胰酶胞内激活、炎症介质过度产生、微循环紊乱、肠屏障功能障碍等，造成胰腺局部乃至远隔器官的损伤是AP发生发展的主要机制[9]。

研究发现，人体内存在两种经典的大麻素受体，CB1受体和CB2受体。这两种受体有44%的氨基酸序列同源，都是7次跨膜的G蛋白耦联受体，相对分子量约为52800。随着对大麻素系统研究的深入，另一种大麻受体GPR55在哺乳类被发现，认为可能是第3种CB受体。它存在于人脑与控制记忆、学习和运动功能相关的区域(背侧纹状体、尾状核和壳)，进而在胰腺、回肠、脾、扁桃体、乳房等周围组织也发现它的表达[6，10-12]。大麻类物质，不论外源性或内源性，可选择性地与这些受体结合而发挥多种生理功能。研究[10-11，13]表明，对于消化系统，大麻类物质具有抗炎、镇痛、调节胃肠运动等作用。新型大麻类制剂O-1602是GPR55的激动剂，是非精神作用的大麻类，能特异激活GPR55。前期实验[5-6]发现，用雨蛙肽诱导小鼠AP模型，同时给予O-1602干预，胰腺局部炎症及损伤有所改善，血浆淀粉酶、脂肪酶活性，以及促炎细胞因子TNF-α、IL-6 水平明显下降；肺、肠道组织及肠系膜淋巴结中髓过氧化物酶(MPO)活性明显降低。提示O-1602有抗炎和保护组织的作用。

本实验用经典方法即腹腔注射大剂量促胰酶分泌剂雨蛙肽(胆囊收缩素的类似物)复制小鼠AP模型，造模后的小鼠血浆淀粉酶及炎症介质MCP-1水平显著增高；O-1602干预可明显拮抗这些变化，与本课题组前期实验所见相似。本研究发现，AP小鼠肠道菌群繁殖加快，肠道细菌过度生长，其发生可能是由于AP时肠道运动功能紊乱，肠内容物排出受阻而淤积于肠道所致；这些变化可为细菌及毒素移位创造条件[14]，一旦出现内毒素血症，炎症细胞进一步活化，促炎细胞因子和炎性介质大量产生和释放，又会对胰腺等组织器官造成第2次打击，并且可能诱发多脏器功能衰竭。

Peyer’s结主要存在于回肠部位，是小肠黏膜内的一组淋巴滤泡，是肠黏膜免疫屏障中的重要组成部分。该淋巴滤泡主要由B细胞和T细胞(CD4为主)组成，在其表面覆盖着一层M细胞，能识别胃肠道内呈现的多种抗原，主要吞噬病毒和肠道病原菌，进而提呈吞入的抗原转交给免疫细胞；后者对提呈的致病抗原进行加工和转运，并在此过程中被激活。激活的免疫细胞经过循环归巢的过程回到肠黏膜固有层，成为分泌IgA为主的浆细胞和效应T细胞，参与肠道局部免疫反应。本研究结果揭示，AP时肠道Peyer’s结CD3、CD4淋巴细胞比例及CD4/CD8比值较正常对照组均有下降，提示T淋巴细胞功能降低，肠道免疫屏障受到影响。肠屏障功能的受损，可进一步促进肠道细菌及毒素的移位，形成AP病程中的因果转化和恶性循环。因此，保护肠道屏障功能，减少细菌移位和减轻内毒素血症，是AP治疗的关键环节之一。

本实验发现，用O-1602干预，可促进益生菌的繁殖，一定程度上抑制AP小鼠肠道致病细菌的过度生长，逆转小肠Peyer’s结中T淋巴细胞及其亚群比例的变化。结果提示，O-1602能减轻AP时机体的病理生理变化，其可能的作用机制包括： (1) 下调血浆炎症介质的水平，进而阻断由其触发的一系列炎症连锁反应；(2) 促进肠内有害细菌的清除，其机制可能与其他大麻类物质一样，通过调节肠道炎症反应、调节胃肠运动功能，促进肠内细菌和毒物的排泄；(3) 改善肠道免疫屏障功能。

综上所述，本实验进一步证实新型大麻制剂O-1602对急性胰腺炎具有一定拮抗作用，其作用机制与O-1602抑制炎症反应、抑制肠道有害细菌的繁殖、调节肠道T淋巴细胞功能等有关。其中作用的具体环节有待进一步的研究。

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Effect of a novel cannabis preparation O-1602 on intestinal immunity and microflora in mice with acute pancreatitis

LIMin1，2，LINSi-si1，SHENLi3，ZHANGRui-qin1，LIYong-yu1

(1. Dept. of Pathophysiology， Institute of Digestive Disease， Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China； 2. Dept. of Physiology， Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi 563000， Guizhou Province, China； 3. Dept. of Pathogen Biology， Medical College， Tongji University ， Shanghai 200092， China)

Objective To investigate effect of a novel cannabis preparation O-1602 on the intestinal immunity and microflora in mice with acute pancreatitis(AP). Methods Twenty one adult C57/BL6 mice were randomly divided into three group： normal control group(control，n=7)， AP group(n=7)， and O-1602 treated group(AP+O-1602，n=7). AP was induced by intraperitoneal injection of caerulein(50μg /kg). Drug vehicle or O-1602(10mg/kg) was given intraperitoneal injection to AP group or AP+O-1602 group respectively, and equivalent volume of normal saline and drug vehicle was given to the control group. The mice were sacrificed at 3h after the last injection， and the blood， the whole small intestine and colon， the intestinal Peyer’s patches were harvested. The microflora in the ileum and colon were examined； the T lymphocytes and its subgroups in the Peyer’s patches were determined. The plasma levels of amylase， interleukin-10(IL-10) and monocyte chemotactic protein 1(MCP-1) were measured. Results Compared to the control group， mice in AP group presented with significantly increased intestinal microflora， plasma amylase activity and levels of IL-10 and MCP-1 (P<0.05 orP<0.01). O-1602 attenuated these changes to some extent(P<0.05). There was no significant difference in the numbers of Peyer’s patches in the intestine among the three groups； but the percentage of CD3+， CD4+T lymphocyte decreased significantly in AP group and AP+O-1602 group(P<0.01 andP<0.05, respectively)， and an indistinctively decreased percentage of CD4+/ CD8+was observed. Conclusion O-1602 protects mice from cearulein-induced acute pancreatitis， which may be related to suppressing inflammatory response， promoting bacteria removal， and regulating T lymphocyte function in intestinal barrier.

acute pancreatitis； cannabis preparation O-1602； intestinal microflora； Peyer’s patches； T lymphocytes； mice

10.16118/j.1008-0392.2016.05.001

2016-06-20

国家自然科学基金(81270477、31571181)

李 敏(1987—)，女，助教，学士.E-mail： 327814831@qq.com

李永渝.E-mail： liyongyu@tongji.edu.cn

R 576

A

1008-0392(2016)05-0001-05