肿瘤精准医疗的手段——个性化抗体偶联药物

韦小越，周展，陈枢青

(浙江大学 药学院，浙江 杭州 310058)

肿瘤精准医疗的手段
——个性化抗体偶联药物

韦小越，周展，陈枢青Δ

(浙江大学 药学院，浙江 杭州 310058)

体细胞突变是肿瘤形成的重要原因和造成肿瘤异质性的关键因素，传统方法并未充分利用这一点对恶性肿瘤进行针对性治疗。精准医疗(precision medicine)是建立在深入了解个体基因组信息和体细胞突变信息的基础上，利用生物信息学和医学技术进行精确诊断，并借助靶向药物等进行精准治疗，为一种全新的个性化医疗模式，在恶性肿瘤的治疗中日益凸显出其临床价值。癌细胞因基因突变产生特异性抗原，是抗体类靶向药物的理想靶点。个性化抗体偶联药物(personalized antibody-drug conjugates，PADC)是将细胞毒性小分子偶联到突变特异性抗体上的一类药物，与传统抗体偶联药物(ADC)不同，其仅特异性识别患者癌细胞上的突变新抗原，与正常细胞无交叉结合。因此PADC能将小分子毒物特异靶向到癌细胞，实现增效减毒的效果，有望成为肿瘤精准医疗的重要手段。本文从体细胞突变产生肿瘤特异性抗原、发现新生抗原到特异性抗体制备、PADC的制备及定点清除肿瘤细胞几方面进行阐述，描绘出PADC作为肿瘤精准医疗手段的蓝图。

体细胞突变；精准医疗；肿瘤突变特异性抗原；个性化；抗体偶联药物

精准医疗是基于基因组信息和疾病体细胞突变信息，分析、鉴定特定患者特定疾病的生物标志物，精确寻找疾病的治疗靶点，并借助靶向药物等手段为患者制定精准的治疗方案[1]。“精准医疗(precision medicine)”计划于2015年1月由奥巴马正式提出，随后6月在第51届美国临床肿瘤学会(ASCO)年会新闻发布会上宣布了TAPUR和NCI-MATCH两项致力于扩展精准医疗范畴的临床研究计划，其短期目标便是治疗肿瘤。体细胞突变造成肿瘤发生并使之具有正常细胞所没有的特异性靶点，是精准医疗的首选靶标；“精确”是精准医疗不同以往的特色，非常适合具有高度异质性的恶性肿瘤治疗(不同时期肿瘤治疗方式见表1)。肿瘤精准医疗的一种有效手段是开发极具靶向性的抗体药物，即制备针对肿瘤突变特异性抗原(tumor-specific mutant antigen，TSMA)的抗体，从而实现肿瘤特异性靶向。个性化抗体偶联药物(personalized antibody-drug conjugates，PADC)是将细胞毒性小分子偶联到肿瘤突变特异性抗体上，使其兼具特异性靶向和强细胞杀伤力的特点，为肿瘤精准医疗的有效治疗方案[2]。

表1 不同时期肿瘤治疗方法比较

ADC：抗体偶联药物，antibody-drug conjugates；TSMA：肿瘤突变特异性抗原，tumor-specific mutant antigens；PADC：个性化抗体偶联药物，personalized antibody-drug conjugates

PADC方案作为肿瘤精准医疗手段，涉及基因测序大数据分析处理、寻找癌细胞特异性新生抗原以及制备特异性抗体和PADC 3方面。具体步骤如下：①基因检测及数据分析：通过高通量基因测序技术获取患者癌细胞的基因信息，利用生物信息技术比对分析，提取重要的体细胞突变，预测筛选出能展现在癌细胞表面的TSMA并初步验证抗原；②制备特异性抗体：制备TSMA，利用噬菌体展示技术或杂交瘤技术制备肿瘤突变特异性抗体，对抗体特异性、亲和力、稳定性和活性等进行评价；③制备PADC：将制备好的抗体与细胞毒性小分子毒物偶联，完成PADC成药性评价后用于患者肿瘤治疗。见图1。

1 肿瘤精准医疗的重要条件——体细胞突变

正常成人体内的细胞分裂增殖、生长和凋亡受到严格控制，细胞数量维持在一定水平以保证机体正常运转；肿瘤的形成是体细胞突变的结果。细胞有丝分裂过程中如DNA双螺旋结构不稳定，或细胞受到外界刺激(如化学、物理、生物刺激)时容易发生DNA突变(包括碱基替换、插入、缺失、重排等)。一部分突变能被细胞自我识别和修复，一部分突变细胞经过组织里微环境的达尔文进化筛选，发生不利突变的细胞会被杀死，而突变后具备生长优势的细胞得以存活下来。DNA突变随着细胞的分裂增殖不断积累，但并非所有的突变都会导致细胞癌变。驱动突变(driver mutation)和伴随突变(passenger mutation)可以区分对细胞影响不同的突变：前者赋予细胞生长优势或者耐药性，并且随着癌细胞的分裂增殖而相对集中，一般分布在与细胞生长密切相关的蛋白中；后者对细胞生长并无太大影响，随机分布在基因组里。一般认为能改变细胞功能的突变需要积累5～7次的突变才能使正常细胞发生癌变[3]，所以一个癌细胞里可以存在多个驱动突变。

体细胞突变赋予了癌细胞有别于正常细胞的特性，这是肿瘤精准医疗的首选靶标[4]。新一代高通量测序技术为体细胞突变的发现提供了必要的信息，通过采集患者肿瘤组织，并以外周血正常细胞为对照，利用高通量全外显子测序(whole-exome sequencing，WES)、全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)或表达谱分析技术(mRNA-Seq)等可以获得肿瘤患者癌细胞和正常细胞的基因序列及基因表达信息，再利用生物信息学技术从测序产生的大数据中抽丝剥茧，鉴定出体细胞突变并进一步筛选突变新生的TSMA[5-6]。目前研究者们已经开发出许多序列数据处理工具，对突变进行初步筛选，如分析单核苷酸突变(single nucleotide variants，SNV)及碱基插入的有GATK、VarScan、SomaticSniper、MuTect、Strelka、JointSNVMix等；分析突变蛋白功能及通路和网络的有ANNOVAR、PolyPhen2、SIFT、HotNet、MuSiC、PathScan等[7-8]。近年来Ensembl、GENCODE、RefSeq、TransFac和Interpro等基因组、转录组及蛋白质组数据库相继建成，为测序数据分析处理提供了非常重要的帮助[7]。利用多种分析工具，挑选出患者肿瘤特异性的突变，确定突变蛋白质的功能及其在细胞的定位，为体细胞突变新抗原的候选提供依据。

分析得到的突变结果按细胞分布可分为膜蛋白胞外区突变，膜蛋白胞内区突变和胞质内及细胞核内蛋白突变。无论哪种突变，其产物都应属于肿瘤特异性蛋白，这有别于传统基于高表达的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，是肿瘤精准医疗的潜在靶点。但这些突变成为肿瘤精准医疗靶标的条件各不相同(见图2)。胞膜外蛋白突变随着蛋白表达而展现于细胞膜外侧，突变后与野生型蛋白结构上的差异即可使之成为TSMA。膜蛋白胞内区突变和胞质内蛋白突变基本一致，依赖人体自身免疫系统，突变后蛋白依靠主要组织相容性复合体 (majorhistocompatibility complex，MHC)分子递呈，展示到细胞外侧才能成为TSMA。大多数肿瘤抗原是由MHCI分子递呈的，也有部分抗原被MHCII分子递呈[9]。蛋白在胞浆中被蛋白酶体水解成8～11个氨基酸大小的多肽片段，通过抗原处理相关转运体(transporter associated with antigen processing，TAP)带进内皮网状组织中与MHCI分子的α链及β2微球蛋白组装成多肽-MHC复合物，再进入高尔基体转移到细胞膜外侧。递呈出来的抗原分2种：一是正常细胞里野生型蛋白的多肽片段本身会被MHC分子递呈，肿瘤细胞突变后多肽也会被递呈，2者根据突变点氨基酸的不同而产生TSMA；二是正常细胞里野生型蛋白不被递呈，突变后因结构变化，水解多肽能与MHC分子结合而递呈到肿瘤细胞表面，因此获得特异性抗原[10]。

图2 不同类型突变产生TSMAFig.2 Different kinds of mutations produce TSMA

每个患者外显子测序结果显示存在成百上千的体细胞突变点，但是最终能成为TSMA的却非常少[11]，主要原因在于每个人的MHC分型是基因决定的，特定分型的MHC分子只能与结构或分子排布互相吻合的多肽结合。根据许多现有的MHC分子和多肽结合相关数据，已有研究者开发出NetMHC[12]、NetMHCpan[13]等在线预测算法。将患者外显子测序结果分析得到的候选蛋白序列输入预测算法，模拟计算含突变点的8～11个氨基酸多肽片段与该患者所有分型的MHC分子的亲和力(affinity)，将预测结果<150nM的视为强结合(strong binding)，150～500 nM之间视为弱结合(weak binding)，>500 nM则视为不结合。对于强结合的多肽，可首选作为肿瘤突变特异性抗原，进入下一步研究。结合力较弱的多肽并非代表完全不被MHC分子递呈，为了进一步验证突变蛋白的递呈，还可通过分离收集癌细胞表面的蛋白，利用LC-MS/MS串联质谱鉴定递呈多肽[14]。目前已有许多预测MHC递呈的突变抗原被实验证实能成为T细胞和B细胞表位[9,15-17]。从获取患者组织，建库进行基因测序，到分析筛选TSMA，只是精准医疗的第一步，但却是肿瘤精准医疗的重要条件。

2 肿瘤靶向治疗的有力武器——抗体偶联药物

树突状细胞疫苗[18]、T细胞免疫疗法[19]、免疫检查点疗法[20-22]、蛋白质、多肽以及核酸疫苗[23]等免疫疗法是目前肿瘤靶向治疗的几种方案。这些方法往往需借助体内免疫系统的激活、T细胞活化增殖才能发挥肿瘤杀伤作用，过程比较复杂，具有一定的滞后性。T细胞(抗原)受体(TCR)与多肽-MHC复合物的识别本身不足以激活T细胞，还需辅助刺激因子的存在。如T细胞表面的CD28分子与抗原呈递细胞(APC)表面的CD80/CD86发生特异性结合，提供共刺激信号激活T细胞。CD80/CD86的表达仅限于特定的细胞类型(如APC)，而肿瘤细胞表面一般不表达此类分子，因此，T细胞疗法需要诱导炎症辅助治疗；然而一旦体内存在大量活化的T细胞，容易引起细胞因子风暴，威胁患者生命[24]。即便特异性T细胞得以激活，在进入体内后如想突破肿瘤部位的物理、生理障碍到达肿瘤细胞表面仍然十分困难。且传统免疫治疗的靶点并非真正的肿瘤特异性，也会伤及正常细胞。另一方面，单抗药物具有靶向治疗特性，其分子大小使得它们更容易到达靶细胞，且在人体内的半衰期不是太短，为肿瘤靶向治疗的好方法，其杰出代表便是抗体偶联药物(ADC)[25]。

ADC被喻为“生物导弹”，由抗体、小分子毒物(IC50在0.01～0.1 nmol/L)以及介导偶联的连接物(linker)组成。小分子毒物能杀伤肿瘤细胞，也会对正常细胞产生较大伤害，其应用受到极大限制。ADC将小分子毒物和抗体连接起来，利用抗体将毒物靶向到靶细胞，使药物集中在肿瘤部位，降低其他组织、器官的药物浓度，起到增效减毒的作用[26]。目前研究常用的小分子毒物主要有海兔毒素(MMAE、MMAF)、阿霉素(DOX)、Calicheamicin、美登素(Maytansine，DM1、DM3、DM4)[27]，其他在研的小分子毒物有α-Amanitin、Tubulysins[28]、pyrrolobenzo-diazepines(PBDs)、duocarmycin、centanamycin和喜树碱类(SN38)[29]等。小分子毒物本身往往不能直接和linker通过化学键链接，需要先进行结构修饰，在适当的位置添加化学反应活性基团，如-NH2、-SH、-OH、-COOH等。而抗体主要通过氨基酸侧链的赖氨酸-NH2和游离半胱氨酸-SH与linker链接。连接抗体与毒性药物的连接物包括可断开的(cleavable)连接物(肽连接、二硫键连接、腙连接)和不可断开的(non-cleavable)连接物(硫醚连接)[30]。linker的功能不仅仅是连接作用，还应维持ADC在细胞外的稳定，且进入癌细胞后能迅速水解释放出小分子药物发挥药效，实现快速清除靶细胞的目的。对于不同的靶细胞和药物，根据体内外实验筛选出适合的连接方式十分重要。通常来说，美登素-抗体偶联物采用二硫键或者硫醚连接[31]，海兔毒素-抗体偶联物的linker是能在溶酶体里被酶切的肽连接或者是不可断开的硫醚连接[32]，Calicheamicin-抗体偶联物采用对酸敏感的腙连接。一般认为，肽连接通过MC-Val-Cit-PABC连接物连接而成，其在细胞内的裂解方式是ADC在血清和中性pH里稳定，但在溶酶体或组织蛋白酶B(cathepsin-B)里迅速断开释放药物，也可能被核内体和细胞质蛋白酶水解。二硫键连接利用从抗体还原而成的半胱氨酸巯基与带有巯基的药物连接而成。胞内最为丰富的硫醇还原型谷胱甘肽浓度在1～10 mM，是胞外血液含量最多的硫醇半胱氨酸的1000倍，因此二硫键linker进入细胞内能迅速被水解；细胞内蛋白质二硫键异构酶家族也可能参与二硫键linker的分解。腙连接通过含酰肼结构的药物与包含腙键与二硫的4-(4-乙酰苯氧)丁酸(AcBut)连接物连接而成，其裂解方式为经酸催化的水解反应断裂，在细胞外近中性(pH 7.3～pH 7.5)的体循环和其他部位中能保持完整性，而在酸性的晚期核内体(pH 5.0～pH 6.5)和溶酶体(pH 4.5～pH 5.0)中可被水解。硫醚连接通过抗体在细胞溶酶体内降解，释放出带有偶联部位氨基酸的药物。

近年来通过定点突变的方法，在不影响抗体亲和性的条件下，定点突变出游离的半胱氨酸，突出游离巯基，一般将Ser突变成Cys，实现特定的药物抗体偶联比(drug-to-antibody ratio，DAR)[33]。Tian等[34]通过突变出非天然氨基酸如p-AF/p-AZ，通过苯丙氨酸伸出抗体外侧的侧链，能很好地与药物偶联。李朝辉等[35]根据Jagath等[33]的方法，将抗CD20抗体OFA(Ofatumumab)的重链恒定区第1位的氨基酸A变成C，经实验检测，突变体保持了原抗体OFA的活性，即亲和性、补体依赖细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性。突变后伸出游离半胱氨酸作为活性基团定点偶联vcMMAE，突变体偶联产物也保持了原抗体的亲和性、CDC、ADCC和稳定性，且体内外细胞毒性都比原抗体明显提高。除了化学偶联方法，利用Sortase A转肽酶[36]、糖基转移酶[37]、谷氨酰胺转移酶[30]等酶促反应的偶联方法也逐渐发展起来。Sortase A酶是细菌细胞膜内的一种转肽酶，可以识别蛋白C端的LPETG结构域，使LPETG结构在苏氨酸和甘氨酸处断裂，再与甘氨酸修饰的小分子连接来制备ADC。Beerli等[36]成功通过酶促法将带LPETG标签修饰的抗体与小分子vcMMAE偶联起来。传统的化学偶联方法主要通过抗体-NH2和-OH与小分子偶联，无法准确控制DAR，而定点突变偶联在不破坏抗体内部二硫键的前提下可以实现均一的DAR，相对而言，酶促法通过酶特异的识别序列，反应条件温和，不破坏抗体结构，且可定量控制抗体载药量，能很好的实现ADC均一性，从而更好地控制剂量，保证药物疗效和安全性。

目前临床使用的抗体偶联药物T-DM1，基于EMILIA(TDM4370g/BO21977)的研究结果，于2013年获得美国食品和药物管理局(FDA)优先审评批准上市。EMILIA是一项在全球范围进行的随机性、开放性III期临床研究，针对991位接受过曲妥珠单抗及紫杉醇类药物化疗的局部晚期乳腺癌患者或者转移性乳腺癌患者，与拉帕替尼+卡培他滨联合用药治疗方法相比，T-DM1治疗的患者中位总生存期延长5.8个月，死亡风险下降32%，严重不良反应出现率更低[38]。上市后用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌患者，其独特的疗效受到临床医生、科研人员和患者的广泛关注，也推动了肿瘤靶向治疗进入新阶段。此外，T-DM1用于治疗早期乳腺癌[39-40]、二线用于晚期HER2阳性的胃癌临床试验也在进行中[41-42]。

3 肿瘤精准医疗的重要突破口——个性化抗体偶联药物

T-DM1的成功为ADC的发展提供了强大动力，现今进入临床研究阶段的抗体偶联药物已达30余种[27,43]。但普通的ADC针对的靶点仅仅是癌细胞高表达，正常细胞低表达，属于“量”上的差异，因此这类ADC也会“误伤”正常细胞，不能满足肿瘤精准医疗的要求。开发肿瘤特异性抗体，为患者制备个性化抗体偶联药物(PADC)能很好地克服药物非特异性带来的副作用。PADC所采用的抗体是针对肿瘤体细胞突变产生的特异性抗原(即TSMA)，正常细胞不存在该突变抗原，其靶点属于“质”上的差异，因此抗体能精确靶向癌细胞。目前研究者们不但可以根据目的蛋白或者短肽制备特异性抗体，还可以针对蛋白单个氨基酸突变或者小片段氨基酸序列变化来制备突变特异性抗体[17,44]。笔者实验室致力于通过对患者进行基因测序筛选得到TSMA用作抗原，制备突变特异性抗体，再通过抗体偶联技术制备肿瘤细胞特异性的PADC，为肿瘤患者开发个性化的精准治疗方案。

突变特异性抗体的获取方法主要有噬菌体展示技术和杂交瘤技术2种。噬菌体展示技术最早在1985年由Smith GP提出，是一项利用亲和结合筛选特异性多肽或蛋白的技术[45]。将随机序列的多肽或蛋白基因片段与丝状噬菌体外壳蛋白基因融合构建噬菌体文库，异源分子随噬菌体衣壳蛋白表达而展示于病毒表面并能保持相对独立的空间结构，使其能够与靶分子配体结合而达到模拟筛选特异性分子表位的作用，且展示的异源分子可在E.coli中大量表达，从而提供了高通量高效率的筛选系统。抗体库(ScFv或Fab)的构建是噬菌体展示技术筛选新抗体的关键，全人源抗体是当今治疗性抗体的主流，它可以减少因物种差异带来的免疫排斥反应[46]。构建好的噬菌体抗体库可用于快速筛选出特异性抗体，是流行病[47]和肿瘤个性化治疗的有效手段。通过构建大容量全人源天然抗体库，理论上可以针对任何抗原筛选出人源性抗体。以筛选得到的TSMA为固定相靶点，经过几轮“吸附—洗脱—扩增”的体外筛选富集，筛选出具有高亲和性高特异性的抗体[48]。噬菌体展示技术所得抗体并非完整抗体，因此通过基因工程技术可组装成完整抗体，用于制备PADC[49]。抗原免疫小鼠制备杂交瘤细胞分泌单克隆抗体也是产生特异性抗体的有效方法，该技术采用的2种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。前者具有抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者可在体外培养无限分裂增殖，2者杂交融合，形成在体外能无限分裂增殖并产生单克隆抗体的杂交瘤细胞[50]。以TSMA为免疫抗原，从杂交瘤细胞群中挑选出可分泌对TSMA特异性识别的单克隆抗体细胞株，后期可经过抗体人源化改造保留抗体活性并减少异源性。

特异性单克隆抗体的制备是PADC的首要任务，也是关键环节，抗体对突变新抗原的特异性和亲和力直接关系到PADC抗肿瘤效果的好坏。目前主要通过酶联免疫吸附法(ELISA)，基于表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)开发的生物分析传感技术BIAcore、基于生物膜干涉技术(BioLayer interferometry technology，BLI)开发的生物分子相互作用检测技术Fortebio和流式细胞术等评价抗体对抗原的亲和性能[51]，同时设置同型对照、阴性对照评价抗体特异性。突变特异性抗体能特异性地靶向肿瘤细胞，其靶点不局限于突变递呈多肽，细胞膜蛋白胞外区的突变也能识别。到达靶细胞的PADC通过抗体介导的内吞进入癌细胞，在细胞内降解，释放出细胞毒物。或在癌细胞间隙中降解，释放出来的小分子毒物再进入癌细胞，最终发挥毒性作用杀死癌细胞，从而实现有效的肿瘤精准医疗[52-53]。

4 结语

随着“组学”技术的发展和生物信息学的应用，人们对肿瘤的认识不断深入、不断精确，精准医疗是建立在对人、病、药物深度认识基础上的高水平医疗技术，应用于肿瘤靶向治疗已是大势所趋。PADC结合抗体绝对特异性靶向和小分子毒物强大的细胞杀伤力这两个特性，同时保留抗体ADCC、CDC作用，可谓“一弹多头”。T-DM1的成功使ADC成为全球靶向药物的“新宠”；而PADC能快速定点消除癌细胞，为肿瘤精准医疗带来了新希望，其独特的治疗优势必然使之成为肿瘤精准医疗新时代的重要手段。

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(编校：吴茜)

Personalized antibody-drug conjugates: a means of tumor precision medicine

WEI Xiao-yue, ZHOU Zhan, CHEN Shu-qingΔ

(College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Somatic mutation is a key factor for tumorigenesis and tumor heterogeneity, which is not fully utilized by traditional methods of malignant tumor treatment. Precision medicine means accurate diagnosis and applyment of targeted drugs to treat diseases with the help of informatics and medical technology, which based on deeply understanding of individual genomic and somatic mutation information. This is a novel model of personalized medicine, and its clinical benefits in the treatment of malignant tumors are being increasingly demonstrated. Somatic mutations endow cancer cells with specific antigens that are perfect target for antibody drugs. Personalized antibody-drug conjugates(PADCs) combine cytotoxic anticancer drugs with mutation special antibodies and are different from ordinary ADCs. PADCs target specifically to mutation antigens, without any cross-binding to normal cells. PADCs can deliver cytotoxic drugs to cancer cells specifically, achieving synergistic and attenuated effect for cancer therapy, which makes PADCs an important means of tumor precision medicine. This paper aims to outline the tumor specific antigens generated by somatic mutations, the discovery of neo-antigens, the preparation of specific antibodies and PADCs, and how PADCs kill cancer cells. The bright future of PADCs as a strategy in tumor precision medicine is described.

somatic mutation; precision medicine; tumor-specific mutant antigens; personalized antibody-drug conjugate

韦小越，女，博士在读，研究方向：肿瘤特异性抗体及ADC研究，E-mail：11319017@zju.edu.cn；陈枢青，通信作者，男，博士，教授，研究方向：精准医学与生物技术药物，E-mail：chenshuqing@zju.edu.cn。

R730.1

A

1005-1678(2016)01-0001-06