HPLC法测定牛奶中甲砜霉素残留前处理方法的研究

章厉劼 杨强

摘 要：甲砜霉素属于氯霉素类的抗生素，作为氯霉素的替代药物在畜牧业养殖业中得到广泛使用。并在2014年1月，我国颁布了《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素残留量的测定 高效液相色谱法》食品安全国家标准。但该方法处理样品时前处理在液液萃取时容易乳化，操作难度大，检测结果标准偏差较大，精密度低，稳定性差。本文用乙腈代替乙酸乙酯做提取液，并添加无水碳酸钠后，成功解决了乳化，且方法操作简单、提取效果好、前处理时间短、结果稳定性好。

关键词：牛奶；甲砜霉素；高效液相色谱

甲砜霉素（Thiamphenicol，分子式为C12H15Cl2NO5S）属于氯霉素类的抗生素，可用于敏感菌如流感嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌属等所致的呼吸道、尿路、肠道等感染。其抗菌作用、抗菌机理及抗菌活性与氯霉素基本相似[ 1，2 ]。作为氯霉素的替代药物在畜牧业养殖业中得到广泛使用。甲砜霉素具有血液毒性，症状多为腹泻、恶心、厌食和多发性神经炎等[ 3 ]。对造血功能的毒性较大，早期可发生血清铁增加，白细胞、血红蛋白及网织细胞减少，由于甲砜霉素可抑制线粒体蛋清质合成，且甲砜霉素治疗后可见到与剂量相关的可逆性骨髓抑制现象。甲砜霉素可抑制红细胞、白细胞和血小板的生成，同时有较大的免疫抑制作用，约比氯霉素强6倍。本研究针对该标准前处理方法进行优化，就标准方法与优化方法的操作、添加回收率、精密度、稳定性进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：“贵阳市三联乳业有限公司”生产的纯牛奶，-18℃保存；

甲砜霉素对照品（纯度99.7%，中国兽药监察所，批号K0241009）；

甲醇、乙腈为色谱纯；

正己烷、乙酸乙酯、无水碳酸钠为分析纯；

固相萃取小柱（SPE）（C18小柱，200mg，3mL，美国Agilent）；

固相萃取小柱（SPE）（C18小柱，500mg，6mL，美国Agilent）；

高效液相色谱仪（Waters 2695型，配紫外检测器，美国Waters公司）；

电子天平（XS105型，德国梅特勒公司）；

涡旋仪（MS2型，德国IKA公司）；

旋转蒸发仪（LABOROTA4000型，德国Heidolph公司）；

振荡器（GFL-3005型，德国GLF公司）；

氮吹仪（DB-3D，TECHNE公司）。

1.2 甲砜霉素标准液的配制

精密称取甲砜霉素标准品约50.1mg（含甲砜霉素约50mg）置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度、摇匀，即成1mg/mL的的甲砜霉素标准储备液。

精密量取甲砜霉素储备液各1mL置于100mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀，即成10μg/mL的甲砜霉素工作液。

1.3 色谱条件

色谱柱（C18，250mm×4.6mm，5μm，美国Thermo）；流动相为乙腈-水（20∶80）；柱温为40℃；流速为1.0mL/min；检测波长为225nm；进样量为20μL。在此色谱条件下对照品溶液色谱图见图1。

1.4 标准曲线与线性范围的确定

精密量取10μg/mL甲砜霉素工作液用流动相梯度稀释成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL甲砜霉素、氟苯尼考混标上机液，注入自动进样瓶中，分别进HPLC测定，结果以峰面积（A）对药物浓度（c）作直线回归，甲砜霉素在0.1～2.0μg/mL范围内，线性良好相关系数大于0.9999，标准曲线见图2。

1.5 阳性添加样的测定及结果

向牛奶中添加20μg/kg、40μg/kg、100μg/kg三种浓度的甲砜霉素，每种浓度作9份，分三个工作日，每个工作日取三种浓度的样品各三份按所拟定的检测方法处理后测定。同时做个空白样品。

方法精密度的测定。相对标准偏差的计算公式为：相对标准偏差RSD=（标准偏差SD÷平均值）×100%。批内相对标准偏差是同一次测定的精密度，批内相对标准偏差也可视为日内精密度；批间相对标准偏差是不同批次测定的精密度。

2 前处理方法研究

2.1 方法一（《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素残留量的测定 高效液相色谱法》）

称取牛奶5.0±0.05g牛奶于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL乙酸乙酯，振荡10min。以4000r/min离心5min，取上清液置于鸡心瓶中；残渣加入乙酸乙酯20mL，重复提取1次，合并2次提取液，于45℃旋转减压蒸发至近干；加入5mL水于鸡心瓶中，超声5min使其溶解，转至50mL离心管中。再加入5mL水于鸡心瓶中重复溶解后转至同一离心管中，加20mL正已烷，振荡5min，4000r/min，室温离心2min，取下层清液备用。C18柱依次用乙腈5mL和水5mL活化。取将备用液过柱，控制流速1min/mL，挤干，用5mL乙腈洗脱。收集洗脱液，于45℃用氮气吹干，用流动相1.0mL溶解残余物，滤膜过滤，供HPLC测定[ 7 ]。阳性添加样的测定及结果见表1。100μg/kg浓度的添加样色谱图见图3。

该方法为我国2014年公布实施的食品安全国家标准《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素残留量的测定 高效液相色谱法》中的前处理方法。该方法中，由于乙酸乙酯与牛奶不互溶，在萃取过程中，会出现不同程度上乳化层，对检测结果造成影响。

2.2 方法二

称取牛奶5.0±0.05g牛奶于50mL聚丙烯离心管中，加入5g无水碳酸钠，再加入5mL乙腈，再涡旋提取2min，以4000r/min离心5min，吸取上清液置于鸡心瓶中（此时，乳脂会分离成液态油状，与乙腈分层）；再加入5mL乙腈重复提取1次，合并2次提取液于同一鸡心瓶中，45℃旋转减压蒸发至近干；加入5mL水，涡旋5min使充分溶解，转移至10mL离心管中；再加入5mL水重复溶解1次，合并溶解液于离心管中，备用。C18柱（500mg/6mL）先后次用乙腈5mL和水5mL活化。取将备用液过柱，控制流速1min/mL，挤干，用5mL乙腈洗脱。收集洗脱液，于45℃用氮气吹干，用流动相1.0mL溶解残余物，滤膜过滤，供HPLC测定。阳性添加样的测定及结果见表2。100μg/kg三种浓度的添加样色谱图见图4。

该方法将提取液乙酸乙酯换为能与牛奶互溶，且极性更大的乙腈，解决了提取时乳化现象。提取时，但因乙腈沸点高于乙酸乙酯，且牛奶中的水与乙腈互溶后，浓缩耗时长，所以将提取液改为5mL，并在加入提取液前，先向样品中加入无水碳酸钠，去除牛奶中的水分。

3 讨论与小结

1）方法一中由于乙酸乙酯与牛奶不互溶，在液液萃取时，如果振速过小，药物提取不彻底；振摇过大，又会出现不同程度上乳化层，高速离心后乳化层仍不能分层。该方法提取过程操作复杂难度大，实验室的温度、振荡强度的不同，都会对乳化程度造成影响。

方法二用乙腈取代乙酸乙酯，很好的解决了提取时的乳化现象后，只需高速涡旋2min，无需再振荡，缩短了提取时间。方法还加入了无水碳酸钠去除牛奶中的水，提取离心后，会出现液液分层，上层为提取液乙腈，下层为乳脂脱水后形成的油脂，取上层提取液旋蒸浓缩至近干，加水溶解即可，无需再用正己烷去脂。方法二在操作难度、提取效果、前处理时间上更优于方法一。

2）从表1、表2可看出方法一甲砜霉素在牛奶中20ng/kg、40ng/kg、100ng/kg三个浓度添加回收率在57.40%～83.00%间；而方法二三个浓度添加回收率在76.15%～95.13%间。可见方法二添加回收率优于方法一。

3）方法一甲砜霉素在牛奶中20ng/kg、40ng/kg、100ng/kg三个浓度添加，批内和批间的标准偏差分别在2.13～7.64%和6.72～12.44%间；而方法二三个浓度添加批内和批间的变异系数分别低于1.59～5.12%和1.01～2.46%。可见方法二的稳定性及精密度优于方法一。

4）本研究在前处理过程中，用乙腈取代乙酸乙酯做提取液，并在提取前加入无水碳酸钠，获得了较好的效果。方法简便、快速、稳定、准确可行。

参考文献：

[1] 林庆华.抗生索在兽医临床应用上的进展.福建畜牧兽医，2000，22（3）39-44

[2] 徐仲钧等.甲砜霉素散对鸡巴氏杆菌病治疗及毒性试验.中国兽药杂志，1996，30（2）34-35.