桃花水母的核糖体RNA基因ITS区序列分析及物种鉴定

迟艳红, 陈华增, 杨翠华, 孙玉苗, 齐继光, 刘光兴, 王 玮(. 青岛海产博物馆, 山东 青岛 6600; . 中国科学院海洋研究所, 山东 青岛 6607; . 中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东 青岛 6600)



桃花水母的核糖体RNA基因ITS区序列分析及物种鉴定

迟艳红1, 陈华增1, 杨翠华1, 孙玉苗2, 齐继光1, 刘光兴3, 王 玮1
(1. 青岛海产博物馆, 山东 青岛 266003; 2. 中国科学院海洋研究所, 山东 青岛 266071; 3. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东 青岛 266100)

利用PCR扩增和DNA测序技术, 获得了青岛野外采集到的桃花水母(Craspedacusta) 核糖体RNA基因ITS区序列。序列比对以及系统进化分析显示, 在青岛采集到的桃花水母与索氏桃花水母(Craspedacusta sowerbyi)的ITS区序列相似度最高, 同源性在93%以上; 同时, 在系统发育树中也与索氏桃花水母聚为一支。研究结果表明, 青岛采集到的桃花水母为索氏桃花水母, 这也是青岛地区桃花水母的新记录。

桃花水母(Craspedacusta); 核糖体RNA基因ITS区; 基因克隆; 序列分析

[Foundation: Special Foundation of Science and Technology Basic Research (2012FY112200)]

桃花水母(Craspedacusta)是一类原始的无脊椎动物, 隶属于刺胞动物门(Cnidaria)水螅纲(Hydrozoa)淡水水母目(Limnomedusae)笠水母科(Olindiidae) 桃花水母属(Craspedacusta)。桃花水母不仅具有极高的观赏价值, 且其作为生物进化历程中的关键物种,具有重要的研究价值。目前国内外共记述桃花水母11种, 除最早发现于英国的索氏桃花水母(Craspedacusta sowerbyi, 1880)[1]和日本的伊氏桃花水母(Craspedacusta iseanum, 1922)[2]外, 其余9种均发现于中国, 分别为宜昌桃花水母(Craspedacusta kawaii, 1907)[3]、中华桃花水母(Craspedacusta sinensis, 1939)[4]、乐山桃花水母(Craspedacusta kiatingi, 1939)[5]、杭州桃花水母(Craspedacusta hangzhouensis, 1980)[6]、信阳桃花水母(Craspedacusta xinyangensis, 1980)[6-7]、四川桃花水母(Craspedacusta sichuanensis, 1984)[8]、秭归桃花水母(Craspedacusta ziguiensis, 1985)[9]、楚雄桃花水母(Craspedacusta chuxionggensis, 2000)[10]和短手桃花水母(Craspedacusta brevinema, 2002)[11]。目前, 国内专家主要通过依据桃花水母的外部形态特征对其进行分类, 但由于桃花水母的形态会因发育时期、生活环境差异等因素而发生变化, 且对一些重要分类依据如触手数目、着生方式、刺丝囊排列方式、生殖腺形状和颜色等特征缺乏明确的规范性描述, 从而给桃花水母的分类工作带来了困难[12]。分子生物学技术的发展为生物物种分类提供了高、精、准的方法, 其中将聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术和DNA测序分析技术结合应用到生物分类中, 具有不受发育时期及环境差异的影响、准确度高、多态性强等特点,目前已经被广泛应用于生物物种的分类学研究领域当中[13-14]。将生物的形态特征和DNA序列有效结合起来, 能够达到更加精准地鉴定生物物种的目的。

核糖体RNA基因(ribosomal RNA gene, 简称rDNA)作为生物体重要遗传物质, 其结构由一个个串联重复序列组成。序列自5′至3′依次为: 非转录区(non-transcribed sequence, NTS)、外部转录间隔区(external transcribed spacer, ETS)、18S rDNA、内部转录间隔区1 ( internal transcribed spacer, ITS1 )、5. 8S rDNA、内部转录间隔区2( ITS2)和28S rDNA。核糖体RNA基因中的18S、5. 8S和28S序列在大部分生物中均具有较高的保守性, 而作为非编码区的ITS区, 其所承受的条件选择压力较小, 因此进化速率较快, 核苷酸替换率较高, 能够提供较为丰富的生物学变异信息, 该区域碱基的序列特征在不同物种当中存在着较显著的差异[15-17]。同时, ITS区位于高度保守的18S、5. 8S和28S rDNA序列之间, 便于进行引物的设计以完成对ITS区序列的PCR扩增和DNA测序, 因此利用ITS区序列分析能够方便有效地进行物种分类鉴定。目前ITS区序列分析已普遍应用于刺胞动物物种的分类鉴定当中[18-20]。本研究对在青岛采集的桃花水母ITS区序列进行了基因克隆和DNA测序, 并对所获得的序列进行相关生物信息学分析, 结合采集水母外部形态特征, 进而完成桃花水母的物种分类鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用标本是2013年8月采自青岛市海尔工业园人工湖的水母, 保存于80%乙醇中。

1.2 实验方法

1.2.1 采集水母的外部形态特征观察

利用体式显微镜对所采集水母首先进行外部形态特征观察, 如伞体形态、有无胃柄、触手类型、辐管数目和位置、平衡囊类型、生殖腺形状和位置、刺胞分布等, 初步确定采集水母的分类地位。

1.2.2 桃花水母总DNA的提取

从80%乙醇保存的水母样本中随机取出10只,经酒精梯度过渡, ddH2O清洗数遍, 用无菌滤纸将水分充分吸干, 置于1.5 mL 高温灭菌的离心管中。加入100 μL TE 缓冲液后, 用研磨棒将样品充分研磨破碎, 再加入2% SDS和2.5 μL蛋白酶K, 置于65 ℃恒温水浴锅中2 h进行完全消化。再经酚-氯仿抽提两次后利用无水乙醇进行沉淀, 用70%乙醇漂洗2次后置于室温下充分晾干, 最后加入TE缓冲液溶解DNA。所获得的总DNA利用NanoDrop分光光度计进行定量检测分析, 再经过琼脂糖凝胶电泳, 确认DNA完整无降解后, 置于–20℃保存备用。

1.2.3 引物的合成和PCR扩增

根据GenBank 中已有的桃花水母ITS区序列,结合相关文献确定扩增目的基因序列的特异性引物,其正向引物为ITSC-F1(5′-GTCGTAACAAGGTTTC CGTAGG-3′), 反向引物为ITSC-R1(5′-GGTAGTCT TGCCTGATCTGAGG-3′)[21], 并由上海生工生物技术有限公司合成。通过PCR扩增获得rDNA-ITS区序列目的片段。PCR反应体系如下: l μL DNA模板, 1×reaction缓冲液, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 2 mmol/L正向引物, 2 mmol/L反向引物以及1.25 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa), ddH2O补足到25 μL。PCR扩增条件: 94 ℃变性4 min, 1个循环; 94 ℃变性50 s, 55 ℃退火50 s, 72 ℃延伸90 s, 35个循环; 72 ℃延伸10 min, 1个循环。

1.2.4 PCR产物的回收纯化, 目的基因的克隆及鉴定

PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳, 使用凝胶成像系统(VDS)观察照相后, 切下特异性目的条带, 并利用DNA胶回收试剂盒(上海生工公司)对目的片段进行回收, 然后克隆到pMD19-T载体(大连宝生物公司)。重组质粒转化至大肠杆菌TOP10菌株,产生的阳性克隆经PCR验证后进行测序。

1.2.5 生物信息学分析

所获得的DNA序列利用Vector软件进行基因组成分析, 并使用NCBI BLAST程序(http: //www.ncbi. nlm.nih.gov) 进行序列同源性比对以及相似性分析,采用Clustal W软件对不同种, 不同来源的桃花水母核糖体RNA基因ITS区序列进行多序列比对分析,并以淡水水母亚纲微水螅属的Microhydrula limopsicola作为外类群, 利用MEGA 4.0软件进行系统发生和进化的分析, 系统树采用Neighbor-joining方法构建。

2 结果

2.1 采集水母的主要形态特征描述

所采集水母体具有桃花水母主要形态特征: 有很发达伞缘刺胞环; 无胃柄; 4条简单辐管; 无向心管; 生殖腺囊状, 仅悬在辐管上; 缘触手只有1种,均匀分布于伞缘上; 关闭型的平衡囊位于缘膜内,形成向心管状。而桃花水母种间的重要分类依据如触手数目、刺丝囊疣形状、生殖腺形状和颜色等因个体大小或发育时期不同, 在所采集的桃花水母的不同个体之间均存在部分差异, 从而无法将其准确定义到种。

2.2 桃花水母ITS区基因的PCR扩增结果

以所提取的桃花水母DNA为模板, 以ITSC-F1/ITSC-R1特异性引物进行PCR扩增。扩增产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 结果显示: 此次PCR扩增获得了长750 bp左右的目的产物(图1)。测序结果显示: 该次PCR扩增所得的目的基因片段共771 bp。Vector软件分析显示: 该目的基因包括18S rDNA的部分片段44 bp、 235 bp的ITS1、161 bp 的5.8S rDNA、304 bp的ITS2以及28S rDNA的部分片段27 bp。

2.3 桃花水母ITS区基因同源序列比对分析

同源基因多序列比对显示, ITS区序列在不同种类的桃花水母中具有较高的保守性。BLAST比对结果显示, 本次采集的桃花水母ITS区序列与各地的索氏桃花水母(C. sowerbyi)ITS区碱基序列具有很高的相似度, 同源性均在93%以上, 如与香山采集的索氏桃花水母(AY513629.1)ITS区序列有100%相似度, 与濮阳采集的索氏桃花水母(AY513628.1) ITS区序列存在99%相似度, 与株洲采集的索氏桃花水母 (AY513634.1) ITS区序列有98%的相似度, 与横溪采集的索氏桃花水母 (AY513625.1) ITS区序列相似度为97%, 与平阳采集的索氏桃花水母(JN874928.1)ITS区序列同源性为93%; 而与其他种类的桃花水母同源性在70%~80%之间, 与四川桃花水母(C. sichuanensis)(AY513620.1)和乐山桃花水母(C. kiatingi)(AY513619.1)的ITS区序列相似度均为77%,与秭归桃花水母(C. ziguiensis)(AY513637.1)ITS区序列相似度为80%, 与中华桃花水母(C. sinensis) (AY730677.1)和短手桃花水母(C. brevinema) (AY513614.1)相似度均为76%。作者利用MEGA 4.0软件, 将来自23个不同地区的桃花水母ITS区序列进行系统学分析, 构建了系统发育树(图4)。分析结果表明, 不同种类的桃花水母亲缘关系远近不同,相同种类不同地区的桃花水母在分子水平上也存在一定差异, 系统发育树结果显示本次实验采集的桃花水母与各地索氏桃花水母聚为一支。综合以上结果推断, 在青岛采集到的桃花水母应是索氏桃花水母(C. sowerbyi)。

图1 桃花水母ITS区基因目的片段的检测Fig. 1 The target fragment of the ITS region in Craspedacusta collected in Qingdao

图2 桃花水母核糖体RNA基因ITS区序列Fig. 2 The sequence of the ITS region of Craspedacusta from Qingdao

图3 桃花水母核糖体RNA基因ITS区序列保守结构域Fig. 3 The conserved domains of the ITS region of Craspedacusta from Qingdao

图4 青岛采集桃花水母ITS区序列与其他桃花水母ITS区序列构建的系统发育树Fig. 4 A phylogenetic tree based on the sequences of the ITS region from different Craspedacusta species

3 讨论

桃花水母作为一类珍稀的淡水水母, 在生态学和生物学研究中具有重要意义。目前对桃花水母的相关研究主要集中于物种分类、生活史、地理分布及生态学影响等方面。桃花水母的分类鉴定工作在生物和生态学研究中起着较为重要的作用。目前对桃花水母的物种分类主要依据其外部形态特征, 如平衡囊的数目和形状、触手的数目和着生方式、生殖腺的颜色和形状、刺丝囊疣的形状及排列方式等[22]。而相关研究表明, 桃花水母在不同发育时期其外部形态特征具有较大的差异, 不同的生活环境也有可能带来形态特征的变化; 此外, 作为桃花水母重要分类依据的部分形态特征尚缺乏规范的描述, 个人主观因素的存在对外部形态的理解有可能造成分类偏差等等。上述情况的存在, 均为分类工作带来了一定的困难。DNA作为生物遗传信息的载体, 在不同发育时期和环境中变异几率微小, 具有遗传性、保守性、稳定性及差异性等特点。因此, 利用DNA分子技术进行桃花水母物种鉴定可以较好地弥补形态学分类的不足。目前, 分子生物技术已被国内外的学者们广泛应用于桃花水母的物种分类鉴定当中, 如通过对18S rRNA基因、核糖体RNA基因ITS区序列、COI等基因序列分析进行了不同地区桃花水母的物种鉴定[21, 23]。

核糖体RNA基因中的18S rDNA、5.8S rDNA 和28S rDNA序列高度保守, 变异信息主要积累于作为非编码区ITS区, 从而使其具有种间区分的特异性, 因此研究中常利用ITS区序列分析进行生物属种间以及亚种层次上的物种鉴定工作。本研究成功获得了桃花水母核糖体RNA基因ITS区序列, 并且多物种同源基因比对显示, ITS区在不同种类的桃花水母中具有较高的保守性。本次实验采集的桃花水母ITS区序列与各地的索氏桃花水母ITS区序列具有最高的相似度, 同源性均在93%以上, 而与其他种类的桃花水母同源性为70%~80%。通过系统发育树分析也能明显看出桃花水母与索氏桃花水母聚为一类。综合以上分析结果可以得出, 此次采集到的桃花水母即是索氏桃花水母。

目前, 我国关于桃花水母的分类研究主要依据外部形态特征。由于传统分类技术手段的局限以及知识认知上的差异, 国外研究学者对我国国内报道的一些桃花水母属的物种分类存在争议。为了精益求精, 科研工作者们继续通过改进形态学特征研究和分子标记的探索以达到更加精准地进行分类鉴定的目的。中国科学院水生生物所通过建立形态度量学参数: 触手密集度和平衡囊密集度, 对桃花水母进行分类比较分析所得结果认为短手桃花水母与中华桃花水母为同一物种[24]。本研究通过系统进化分析显示, 短手桃花水母与中华桃花水母同源性非常高, 达99%, 且在系统进化树上中聚为一支。通过以上形态学特征和分子生物学的综合分析, 认为该两种水母有可能为同一个物种。同理, 四川桃花水母与乐山桃花水母ITS区序列相似度也非常高, 为99%,在系统学树中聚为一支, 因此认为这两种水母有同为一个物种的可能, 但具体是否为同一物种还需进一步分析定论。目前分子生物学技术逐渐应用于桃花水母的生物生态学研究当中[25], 日趋完善的生物信息学平台, 如索氏桃花水母cDNA文库的建立[26]、索氏桃花水母线粒体DNA基因组的确定[27]以及各地各种桃花水母分子标记的获得等, 为以后桃花水母的生长发育、系统进化分析以及分类鉴定等研究奠定了坚实的基础。对于目前国内存在的桃花水母同物异名现象[12, 28], 还有待于结合形态学和分子生物学做进一步地研究, 使桃花水母的分类鉴定工作更加准确而有效。

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(本文编辑: 康亦兼)

Sequence analysis of the ribosomal RNA gene internal transcribed spacer region and species identification of Craspedacusta

CHI Yan-hong1, CHEN Hua-zeng1, YANG Cui-hua1, SUN Yu-miao2, Qi Ji-guang1, LIU Guang-xing3, WANG Wei1
(1. Qingdao Marine Product Museum, Qingdao 266003, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)

Mar., 5, 2015

Craspedacusta; ITS region; Gene cloning; Sequence analysis

The ribosomal RNA gene internal transcribed spacer (ITS) region of Craspedacusta from Qingdao was isolated using the polymerase chain reaction followed by sequencing. Homology and phylogenetic analyses revealed that the ITS region of Craspedacusta showed a high similarity with Craspedacusta sowerbyi (>93%). Simultaneously, our results showed that this region is closely related to C. sowerbyi using a phylogenetic tree. The present data suggest that the Craspedacusta from Qingdao are closely related to C. sowerbyi. This is a new study about Craspedacusta in Qingdao.

Q78

A

1000-3096(2016)02-0035-06

10.11759/hykx20150305001

2015-03-05;

2015-07-08

科技基础性工作专项项目(2012FY112200)

迟艳红(1987-), 女, 山东潍坊人, 助理工程师, 硕士, 主要从事生物分类鉴定, 电话: 0532-82864949, E-mail: chiyanhonglucky@163.com