刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子特征

付国良, 单金红, 胡燕红, 谢金珠, 晏燕花, 黄晓红(. 福建师范大学 生命科学学院, 福建省发育与神经生物学重点实验室, 福建 福州 3507; 2. 江西省东乡县第一中学， 江西 东乡 33800)



刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子特征

付国良1, 2, 单金红1, 胡燕红1, 谢金珠1, 晏燕花1, 2, 黄晓红1
(1. 福建师范大学 生命科学学院, 福建省发育与神经生物学重点实验室, 福建 福州 350117; 2. 江西省东乡县第一中学， 江西 东乡 331800)

从刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)滋养体/包囊前体cDNA文库中筛选出了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(CiGAPDH), 定点诱变CiGAPDH基因开放阅读框内的非通用密码子后, 构建其原核表达载体pGEX-4T-3/CiGAPDH, 转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中, 用异丙基硫式-B-D-半乳糖苷诱导表达, 结果大肠杆菌成功表达了rCiGAPDH蛋白。用抗rCiGAPDH蛋白的鼠血清进行免疫印迹分析, 结果抗血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然CiGAPDH蛋白, 其表观分子质量为37.3 ku, 与根据氨基酸序列推算的理论值相符; 实验表明rCiGAPDH蛋白具有很好的免疫原性, 而且CiGAPDH在生活史的各阶段均有表达, 符合持家基因的特征。利用间接免疫荧光抗体实验(IFAT)检测天然CiGAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫上的定位, 结果表明天然CiGAPDH蛋白主要分布在幼虫的细胞质内, 且在胞口位置分布最多。对CiGAPDH的进一步研究可能为刺激隐核虫感染的药物靶点的寻找多条线索。

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans); 甘油醛-3-磷酸脱氢酶; 原核表达; 定位

[Foundation : The work was supported by grants from JK project from Fujian Provincial Department of Education (JK2013008), Natural Science Foundation of Fujian Province (2014J01120), and Major Project in Agriculture of Fujian Province (2013NZ0002-5)]

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种寄生于热带、亚热带海水鱼皮肤和鳃部的遍身性纤毛虫,隶属于前口纲(Prostomatea)、前管目(Prorodontida)、隐核虫科(Crytocaryonidae)、隐核虫属(Cryptocaryon)[1]。刺激隐核虫最早于1937年由日本学者Sikama在海水观赏鱼身上发现[2], 其生活史大致可分为滋养体(trophonts)、包囊前体(protomonts)、包囊(tomonts)和幼虫(theronts) 等4个阶段[3], 幼虫对鱼类血清和黏液有趋向性, 可主动寻找宿主[4]。它的宿主范围广泛, 除莹斑篮子鱼(Siganus oramin)外, 几乎所有海水硬骨鱼类都是刺激隐核虫的易感宿主[5-6]。刺激隐核虫病以病鱼皮肤、鳃和眼出现大量小白点为特征, 俗称“海水小瓜虫病”[3, 7]或“白点病”[3]。由于刺激隐核虫在适宜条件下, 完成一个生活史所需的时间很短(不到一周),而且繁殖率又很高, 每轮生活史虫数可增加200多倍, 很容易在密度大的养殖鱼类中爆发流行, 造成鱼类的群体死亡, 给海水硬骨鱼的集约化养殖带来了巨大的经济损失。因此, 寻找有效的防治方法至关重要。目前, 由于对刺激隐核虫的病原生物学缺乏深入研究, 尚无有效且安全的预防和治疗方法。虽然采用物理和化学药物治疗[8]及中草药治疗[9]刺激隐核虫病, 能起到一定的效果, 但或多或少都存在一些不足, 如药物对鱼的毒性, 鱼体活力下降、停止摄食、药物在鱼体内的残留等, 既不能彻底治愈刺激隐核虫病, 还会造成食品安全和环境污染隐患。随着基因重组和分子生物学技术的发展和应用, 从分子水平上研究刺激隐核虫的病原学, 进而寻找有效防治方法已成为人们关注的重点。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是维持生物生命活动的一个关键酶, 参与糖酵解、糖原异生以及卡尔文循环等能量代谢过程, 与ATP的合成密切相关[10]。该酶参与细胞的基本代谢过程, 其编码基因被认为是持家基因[11]。GAPDH几乎在所有组织中都高水平表达且通常在同种组织或细胞中表达量基本恒定, 所以被广泛作为抽提总RNA及蛋白质免疫印迹(Western blot)等操作的标准化依据[12]; 其主要功能是在各组织细胞中以四聚体的形式催化3-磷酸甘油醛生成1, 3-二磷酸甘油酸, 是糖酵解反应的关键酶。随着对GAPDH 功能的深入研究, 人们发现GAPDH 除了作为关键酶参与能量代谢外, 还参与许多其他生理功能, 如参与DNA复制和DNA损伤修复[13-14]、促进细胞凋亡[15]、参与膜融合和膜转运[16]等, 从而引起细胞功能的变化, 因此GAPDH是一个多功能酶,与生物体内能量产生以及生命活动正常有序的进行密切相关。虽然目前针对GAPDH的研究报道很多,但有关刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(CiGAPDH)基因的相关报道至今未见。作者根据刺激隐核虫cDNA文库中的EST序列信息, 筛选得到含刺激隐核虫GAPDH基因(Genbank登录号: KP662711)的克隆, 构建了pGEX-4T-3/CiGAPDH的重组质粒, 在E. coli BL21(DE3)菌中进行重组蛋白的诱导表达,并对表达产物进行了亲和层析纯化和鉴定, 以期为进一步研究CiGAPDH在刺激隐核虫的能量代谢及其在生长、发育中的作用奠定基础, 为研究刺激隐核虫病原生物学提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

刺激隐核虫XP7.2虫株于2009年7月采自福建霞浦, 并在本实验室传代培养。实验用宿主鱼是褐菖鮋(Sebastiscus marmoratus), 购自福建马尾海产批发市场, 无特定病原(specific pathogen free , SPF)级昆明小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。刺激隐核虫XP7.2株的滋养体cDNA文库由本实验室构建。含重组质粒pTripIEx2/CiGAPDH的Escherichia coli BM25.8、E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)、pGEX-4T-3均由本实验室保存。

1.2 CiGAPDH基因序列及其蛋白的分子进化分析

根据EST序列信息找出对应的细菌克隆后, 再利用pTripIEx2上的一对通用引物(上游引物为5′-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3′, 下游引物5′-TAA TACGACTCACTATAGGG-3′)进行测序.将测序结果与Genbank中的已知基因进行比对, 鉴定出这个基因为GAPDH, 然后使用在线软件找出CiGAPDH基因的开放阅读框及推导出其编码的氨基酸序列, 并对氨基酸序列的结构域以及亚细胞定位进行预测,再利用Mega4.0软件以NJ法构建CiGAPDH基因的系统发生树。

1.3 反转录PCR(RT-PCR)检测CiGAPDH基因的时空表达情况

首先根据CiGAPDH及CiActin基因的开放阅读框, 分别设计CiGAPDH及CiActin基因的特异性引物。CiGAPDH基因的上游引物序列: (CP1)5′-ACGGATCCATGGCTGATAAACATTAC-3′; 下游引物序列: (CP2)5′-ACCTCGAGTCAATGTAAATT TCCATC-3′, CiActin基因的上游引物序列(AP1)5′-ATGGCCGAAGACTAACAAGCAG-3′; 下游引物: (AP2)5′-TCAGAAGCATTTTCTGTGTACA-3′。用Trizol试剂盒(Takara, 大连)分别提取刺激隐核虫滋养体/前包囊、包囊、幼虫各期虫体总RNA,用微量分光光度计检测提取的总RNA浓度。按照RNA PCR 试剂盒(avian myeloblastosis virus, AMV)Ver.3.0(Takara, 大连)的说明建立10 μL反应体系, 分别逆转录得到相应发育期虫体的单链cDNA。反应条件为: 30℃10 min、42℃ 30 min、95℃ 5 min、5℃ 5 min。以上述制备的各期虫体的cDNA为模板进行PCR扩增, 分别加入引物AP1、AP2扩增CiGAPDH, 加入AP1、AP2扩增CiActin, 反应条件为: CiGAPDH基因为(94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min 10 s) ×30个循环。内参基因CiActin为(94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min 20 s)×30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 检测CiGAPDH基因在刺激隐核虫各期虫体中的时空表达情况。

1.4 CiGAPDH基因的定向诱变及原核表达载体的构建

CiGAPDH基因的开放阅读框中含有3个非通用密码子(2个TAA和1个TAG), 为了在大肠杆菌表达系统里成功表达, 需要将它们诱变为CAA和CAG,根据CiGAPDH的基因序列, 按照GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System试剂盒(Invitrogen, 加利福尼亚州, 美国)说明书设计诱变引物(表1)。按照质粒DNA小量提取试剂盒(Biospin Plasmid DNA Extraction Kit)(BioFlux, 杭州)的操作说明, 提取重组质粒pTripIEx2/CiGAPDH后进行质粒的甲基化反应, 产物作为诱变PCR反应的模板, 加入142th诱变引物, 配制诱变反应液进行PCR反应, 形成诱变后的线性质粒分子; 将PCR产物转入到E. coli DH5α细胞, 甲基化过的模板质粒DNA被McrBC内切酶酶切, 只剩下诱变好的线性质粒在细菌内环化。然后送往生工生物工程股份有限公司测序, 用BioEdit进行序列对比分析正确后, 用同样的方法依次对187th和919th位点进行诱变。根据诱变后的CiGAPDH基因开放阅读框的序列, 设计亚克隆引物, 上游引物序列: 5′-ACGGATCC ATGGCTGATAAACATTAC-3′(下划线为BamH I酶切位点); 下游引物序列5′-ACCTCGAGTCAATGTAAATTTCCATC-3′(下划线为 Xho I酶切位点)。以三次诱变成功后的重组质粒pTripIEx2/CiGAPDH为模板, 加入亚克隆引物进行PCR反应, 反应条件为: (94℃30 s, 54℃30 s, 72℃ 1 min 10 s)×30个循环。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收。用限制性核酸内切酶BamH I(Takara,大连)和Xho I(Takara, 大连)分别双酶切纯化的PCR产物和载体pGEX-4T-3, 酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并纯化, 按1∶3的摩尔比混合载体片断与目的基因片断, 加入T4连接酶将回收的片段连接起来, 目的基因片段重组至原核表达载体pGEX-4T-3上, 将连接产物转化入E. coli DH5α, 挑取阳性克隆在生工生物工程有限公司测序鉴定。

表1 CiGAPDH基因各诱变位点的诱变引物Tab. 1 Mutagenic primers of CiGAPDH

1.5 重组蛋白rCiGAPDH在大肠杆菌中的诱导表达

将测序正确的重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)细胞中, 37℃过夜培养, 挑取单菌落于LB培养基(含氨苄青霉素50 mg/L)中, 37℃ 200 r/min振荡培养过夜后, 培养物以1∶100的比例稀释, 继续振荡培养数小时至A600约为0.3~0.5, 加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG) (生工生物工程股份有限公司, 上海)至终浓度为0.5 mmol/L, 28℃ 180 r/min诱导外源基因表达4 h。随后10000 r/min离心10 min收集菌体, 用4℃预冷的TNE 缓冲液重悬菌体, 加入溶菌酶至浓度100 mg/L, 放置1~2 min置于冰上进行超声破碎, 4℃ , 10000 r/min离心20 min, 收集上清和沉淀。取部分上清用谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase, GST)SefinoseTMResin纯化胶(GST SefinoseTMResin) (生工生物工程股份有限公司, 上海)纯化。将菌体沉淀、菌体上清、纯化后的rCiGAPDH蛋白和GST分别加入等体积的2倍浓度的样本缓冲液中, 沸水中加热变性5 min, 进行SDS-PAGE(浓缩胶为3%, 分离胶为12%), 最后用考马斯亮蓝G250染色, 鉴定重组蛋白的表达, BCA蛋白定量检测试剂盒(生工生物工程股份有限公司,上海)测定蛋白浓度。

1.6 抗rCiGAPDH和GST蛋白鼠血清的制备

将纯化的rCiGAPDH和GST蛋白(由于重组蛋白含有GST蛋白, 所以免疫小鼠时用GST做对照) 在PBS中透析并调节浓度后, 分别与等体积的弗氏佐剂(Sigma, 上海)充分乳化后腹腔注射6周龄的SPF级雌性昆明小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司, 上海), 抗原蛋白剂量为80 μg/鼠。随后加强免疫2次, 每次免疫间隔时间为两周。其中第一次免疫用弗氏完全佐剂, 加强免疫均用弗氏不完全佐剂。免疫完成10 d之后从免疫小鼠的心脏穿刺取血, 分离抗rCiGAPDH和GST蛋白鼠血清, –30℃保存备用。

1.7 免疫印迹试验(Western blotting)鉴定重组蛋白的表达

蛋白样品经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后, 电转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上, 电转结束后PVDF膜用3%的脱脂奶粉37℃封闭1 h, 加抗血清(1∶100稀释), 37℃孵育1 h.用PBS振荡清洗膜3次后加作为第二抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体(MP biomedicals, 加利福尼亚州, 美国)(1∶1000), 37℃孵育1 h.邻苯二胺(DAB, 0.5 mg/mL)显色后, 用灭菌去离子水终止显色反应。

1.8 间接免疫荧光抗体试验(Indirect Immunofluorescent Antibody Test, IFAT)检测天然CiGAPDH蛋白在幼虫中的定位

收集刺激隐核虫幼虫用0.5%的甲醛溶液固定30 min, 离心(1500 r/min, 5 min), 弃上清, 取100只左右的幼虫制片, 加抗rCiGAPDH蛋白鼠血清(1∶100稀释于IFAT稀释液中), 对照组加抗GST鼠血清(1∶100稀释于IFAT稀释液中), 37℃孵育1 h。PBS洗玻片3次后分别加入Alexa 594标记的羊抗鼠IgG抗体(Invitrogen, 加利福尼亚州, 美国)(1∶100稀释于IFAT稀释液中), 37℃孵育1 h。4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染核,抗荧光淬灭PVP封片液(碧云天, 上海)封片, 观察并拍照。

2 结果及分析

2.1 CiGAPDH基因的生物信息学分析结果

该基因的cDNA全长是1143 bp, 开放阅读框为1035 bp, 可编码344个氨基酸, 序列信息详见图1。预测CiGAPDH蛋白的分子质量约为37.3 ku, 理论等电点pI为6.66。该基因的开放阅读框中含有3个非通用密码子, 两个TAA和一个TAG。它们在其他大多数生物中为终止密码子。为了能在大肠杆菌表达系统里表达CiGAPDH基因, 需要将它们诱变为编码谷氨酰胺的通用密码子CAA和CAG。CiGAPDH蛋白含两个结构域, 即位于N端的辅酶NAD+结合结构域和位于C端的催化结构域, 详见图2。用在线软件PSORT Prediction对刺激隐核虫CiGAPDH蛋白的亚细胞定位预测发现CiGAPDH蛋白主要定位在细胞质中。通过构建系统发育树发现CiGAPDH和海水派金虫及四膜虫的GAPDH同属一个进化枝(图3),说明它们彼此的亲缘关系较近, 这与它们同属于纤毛虫这一生物学分类地位相符。

2.2 CiGAPDH基因的时空表达情况分析结果

图1 CiGAPDH基因的开放阅读框及其编码蛋白的氨基酸序列Fig. 1 The full-length cDNA sequence of CiGAPDH and its deduced amino acid sequence

以刺激隐核虫滋养体/前包囊期、包囊和幼虫的单链cDNA为模板, CiGAPDH基因的特异性引物(CP1, CP1)为引物, 体外扩增CiGAPDH基因后进行琼脂糖凝胶电泳(以CiActin基因作为内参基因), 大约在1035bp处均有条带(图4), 与理论值相符。表明CiGAPDH基因在刺激隐核虫各发育阶段均有表达,符合GAPDH基因为持家基因的性质。

图2 刺激隐核虫CiGAPDH蛋白的结构域预测Fig. 2 The predicted conserved domain of CiGAPGH from C. irritans

图3 基于11种不同GAPDH蛋白氨基酸序列构建的NJ系统发生树Fig. 3 Neighbor-joining phylogeny tree of 11 GAPDH proteins

图4 CiGAPDH基因在刺激隐核虫不同发育期的表达情况Fig. 4 CiGAPDH expression in C. irritans at different stages

2.3 CiGAPDH基因的定向诱变

从刺激隐核虫的cDNA文库中筛选克隆的CiGAPDH基因依次进行3次定向诱变, 每次诱变后均对目标序列经过测序确认诱变结果。并利用BioEdit软件比对诱变前后序列, 结果表明所有需要诱变位点的T碱基都变成了C碱基。以诱变后的重组质粒pTripIEx2/CiGAPDH为模板, 进行PCR扩增, PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。结果显示, 在约1035bp处出现目的条带(图5), 与预期的基因长度值相符。

图5 CiGAPDH基因的扩增结果Fig. 5 Amplification of the modified ORF of CiGAPDH

2.4 原核表达载体的构建

上述PCR产物经BamH I和Xho I双酶切, 与同样进行双酶切的 pGEX-4T-3连接, 得到重组质粒pGEX-4T-3/CiGAPDH, 转化入E. coli DH5α感受态细胞中。随机挑取3个单菌落并用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定, 酶切产物与预期大小一致(图6)。提取初步鉴定成功的重组质粒进行测序, 结果显示插入基因与诱变后的CiGAPDH基因完全一致, 证明CiGAPDH基因被成功插入到pGEX-4T-3中, 即pGEX-4T-3/CiGAPDH构建成功。

2.5 重组蛋白rCiGAPDH的诱导表达

将重组质粒pGEX-4T-3/CiGAPDH转化入E. coliBL21(DE3)细胞中, 用IPTG诱导表达4h后, 超声破碎, 离心后收集上清和沉淀进行检测, 并用GST纯化胶对上清中的表达产物进行纯化。SDS-PAGE结果显示: 在分子质量约为63.3 ku处有一明显条带, 与GST-CiGAPDH融合蛋白的预期大小一致(CiGAPDH的分子质量37.3 ku, GST为26 ku), 在可溶相和不溶相中均有表达, 说明CiGAPDH基因在大肠杆菌中成功表达(图7)。

图6 重组质粒pGEX-4T-3/ CiGAPDH的双酶切鉴定Fig. 6 Identification of the recombinant plasmid pGEX-4T-1/CiGAPDH by double restriction digestion

图7 大肠杆菌表达重组蛋白rCiGAPDH的SDS-PAGE分析结果Fig. 7 Prokaryotic expression of recombinant CiGAPDH analyzed by SDS-PAGE

2.6 重组蛋白rCiGAPDH的免疫印迹试验鉴定结果

刺激隐核虫滋养体/前包囊、包囊和幼虫全虫蛋白经SDS-PAGE后, 电转到PVDF膜上, 并以GST作对照, 用抗rCiGAPDH免疫鼠血清和抗GST免疫鼠血清分别做第一抗体进行免疫印迹试验分析(图8)。结果显示在分子质量约为37.3 ku处均有一条特异性反应条带, 说明刺激隐核虫内源性CiGAPDH的分子质量是37.3 ku, 与理论预测值相符; 其次, Ci-GAPDH蛋白在刺激隐核虫各期虫体内均有表达; 结果还表明rCiGAPDH蛋白具有很好的免疫原性。

图8 免疫印迹试验分析rCiGAPDH蛋白免疫鼠血清与刺激隐核虫天然CiGAPDH蛋白的抗原抗体反应Fig. 8 Western blot analysis of native CiGAPDH from C. irritans with mouse antiserum against rCiGAPDH

2.7 天然CiGAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫中的定位

以抗rCiGAPDH蛋白免疫鼠血清为第一抗体、Alexa 594标记的羊抗鼠IgG抗体为第二抗体, 同时以抗GST鼠血清作对照, 运用IFAT法检测天然CiGAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫中的定位(图9)。结果显示天然CiGAPDH蛋白主要分布在刺激隐核虫幼虫的细胞质内, 且在胞口位置分布最多, 这与CiGAPDH蛋白进行亚细胞定位预测的结果是一致的。

3 讨论

刺激隐核虫病严重危害我国东南沿海的经济鱼类养殖业, 被农业部列入二级动物疫病名录[17-18],对该病防治的重要性可见一斑。从分子生物学水平深入了解其病原生物学将对阻断该病的传播具有积极的意义。本实验通过对克隆自刺激隐核虫的GAPDH同源基因(CiGAPDH)的序列分析、对重组蛋白的特征的分析、以及通过重组蛋白制备免疫血清,对刺激隐核虫各个发育期的内源蛋白的表达和定位的分析和检测, 证实了该基因确属于GAPDH家族基因, 具有如下特征: CiGAPDH编码的多肽链中包含两个蛋白结构域, 即位于N端的辅酶NAD+结合结构域和位于C端的催化结构域, 这是该家族蛋白的显著特征; 该多肽链与海水派金虫及四膜虫的GAPDH同属一个进化枝, 彼此的亲缘关系较近, 这与它们同属于纤毛虫这一生物学传统分类地位相符;从转录和翻译水平上都可以看出, CiGAPDH 在生活史各期均有表达, 符合持家基因的性质; 而且重组蛋白的表观分子量和内源蛋白的表观分子量均符合根据基因编码序列推测出的理论值; CiGAPDH主要分布于细胞质中, 这与GAPDH主要在细胞质内催化糖酵解反应这一功能相适应; CiGAPDH基因还具有一些纤毛虫基因的特点: CiGAPDH基因的开放阅读框中含有3个编码谷氨酰胺的非通用密码子(2个TAA和1个TAG, 它们在其他大多数生物中却为终止密码子)[19]。

图9 天然CiGAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫中的免疫荧光定位结果Fig. 9 Localization of native CiGAPDH in the theronts by IFAT

为了在大肠杆菌表达系统里成功表达这个带有非通用密码子的基因, 本实验通过PCR定向诱变的方法, 将它们诱变为编码谷氨酰胺的通用密码子CAA和CAG, 将诱变成功后的开放阅读框亚克隆到大肠杆菌中, 将诱导表达出来的重组蛋白rCiGAPDH用来免疫SPF级雌性昆明小鼠, 获得抗rCiGAPDH蛋白鼠血清, 免疫印迹试验显示: rCiGAPDH蛋白具有很好的免疫原性和反应原性, 抗rCiGAPDH蛋白鼠血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然CiGAPDH蛋白。从而表明, 通过基因诱变将纤毛虫的基因在常规的表达系统中表达是完全可行的。

GAPDH是多功能的蛋白质, 除了参与催化糖酵解为细胞提供能量外, 还参与调控膜融合和膜转运过程[20-25]等多种细胞过程, 对CiGAPDH在刺激隐核虫的细胞生理以及感染方面的作用有待进一步研究,这些研究将为防治刺激隐核虫病药物靶点的发现提供理论基础。

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[24] Bryksin A V, Laktionov P P. Role of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in vesicular transport from Golgi apparatus to endoplasmic reticulum [J]. Biochemistry-Moscow, 2008, 73(6): 619-625.

[25] Tisdale E J, Kelly C, Artalejo C R. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interacts with Rab2 and plays an essential role in endoplasmic reticulum to Golgi transport exclusive of its glycolytic activity [J]. J Biol Chem, 2004, 279(52): 54046-54052.

(本文编辑: 梁德海)

Molecular characterization of a Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Cryptocaryon irritans

FU Guo-liang1, 2, SHAN Jin-hong1, HU Yan-hong1, XIE Jin-zhu1, YAN Yan-hua1, 2, HUANG Xiao-hong1
(1. Fujian Key Laboratory of Developmental and Neural biology, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China; 2. Dongxiang No.1 High School of Jiangxi, Dongxiang 331800, China)

Jul., 7, 2015

Cryptocaryon irritans; glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; prokaryotic expression; location

A GAPDH gene (CiGAPDH) was cloned from the cDNA library of Cryptocaryon irritans trophonts. After modification, the non-universal genetic codons in the open reading frame (ORF) of CiGAPDH were inserted into plasmid pGEX-4T-3 to construct the prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-3/CiGAPDH. The recombinant plasmids were transformed to Escherichia coli BL21 (DE3) cells, which were then induced to express the foreign gene by the addition of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside. SDS-PAGE results showed that rCiGAPDH was successfully expressed in E. coli cells. The results from Western blot analysis showed that antiserum against rCi-GAPDH recognized the native CiGAPDH protein from different stages of C. irritans, the molecular mass of which was 37.3 ku, in agreement with the calculated mass. Localization of native CiGAPDH protein in theronts was detected using an indirect immunofluorescence cell imaging technique. The results showed that the native CiGAPDH protein was mainly distributed in the cytoplasm of C. irritans theronts, with notable accumulation around the cytostomes. Further study on the roles of CiGAPDH in the parasite development and infection is expected to provide important information to identify potential drug targets for control of cryptocaryosis.

A

1000-3096(2016)02-0011-09

10.11759/hykx20150412002

2015-07-07;

2015-10-11

福建省教育厅JK项目(JK2013008); 福建省自然科学基金项目(2014J01120); 福建省农业重大专项(2013NZ0002-5)

付国良(1988-), 男, 江西九江人, 硕士, 主要从事病原分子生物学研究, E-mail: fu-guo-liang@163.com; 黄晓红, 通讯作者,教授, E-mail: biohxh@fjnu.edu.cn