水产胶原蛋白的提取纯化及理化特性的研究进展

杨桠楠， 李彩燕， 钱国英（浙江万里学院 生物与环境学院， 浙江 宁波 315100）



水产胶原蛋白的提取纯化及理化特性的研究进展

杨桠楠， 李彩燕， 钱国英
（浙江万里学院 生物与环境学院， 浙江 宁波 315100）

胶原蛋白是一种重要的功能性蛋白质。水产动物源胶原蛋白因其丰富的来源和特殊的优点受到广泛关注， 本文对国内外水产源胶原蛋白的提取、纯化方法以及理化性质的研究进展了综述， 并对今后的研究方向做了展望， 以期为水产胶原蛋白的进一步应用研究提供一定的理论基础。

水产胶原蛋白； 提取； 纯化； 理化性质

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胶原蛋白是生物体内重要的结构蛋白， 是支持机体结缔组织的主要组成部分， 也是动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白， 占蛋白质总量的25%～30%。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递， 以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系［1］。胶原蛋白所特有的三重螺旋的氨基酸结构使它具有许多很有用的特性， 如高拉伸强度、良好的生物相容性、低抗原性、低刺激性和低细胞毒性以及促进细胞生长的性能［2］。

目前， 胶原蛋白因其良好的生物学性能在生物医药材料、食品、美容等方面得到了广泛的关注。陆生动物组织一直是人们获取天然胶原蛋白的主要途径， 但由于疯牛病（BSE）、口蹄疫（FMD）、禽流感等疾病的发生， 使人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的安全性产生了质疑， 而水产胶原蛋白因其丰富的来源和相较于陆生动物良好的生化性能和独特的优点正在被广泛研究， 如良好的凝胶性、高分散性、低黏度性、低抗原性、高可溶性、易被蛋白酶水解等特性。我国是水产大国， 随着水产养殖规模的扩大和加工业的发展， 许多水产品包括其加工后的废弃物含有丰富的胶原蛋白， 可以成为胶原蛋白的良好来源。本文重点介绍水产动物源胶原蛋白的提取、纯化方法及理化性质， 以期为更好地综合利用水产品这一生物资源及进一步开发水产胶原蛋白提供参考。

1 水产胶原蛋白的提取纯化方法

1.1 提取方法

水产胶原蛋白的提取方法主要有热水提取［3］、碱法提取［4］、酸法提取［5］、酶法提取［6］等方法。

热水浸提的温度是100℃左右［3］， 而胶原蛋白的热变性温度一般在30℃左右［1］， 高温环境会直接导致胶原蛋白变性形成明胶。张强等［7］发现热水浸提会使鲢鱼皮胶原蛋白的微观结构呈现片状结构， 不再具有明显的胶原蛋白网状结构。碱法提取不仅会使水产胶原蛋白的氨基酸结构破坏， 而且使水产胶原蛋白提取率降低［8］， 所以这两种提取方法并不常用。

酸法提取是利用低离子浓度酸性条件破坏分子间盐键和希夫碱， 引起胶原纤维膨胀、溶解， 采用酸法提取的胶原蛋白通常称为酸促溶性胶原蛋白（ASC）。由于无机酸（如盐酸、硫酸）使胶原纤维的膨胀极不明显， 通常选择有机酸提取胶原蛋白。常用有机酸溶剂有乙酸、乳酸、柠檬酸， 其中， 以乙酸最为常用， 陈丽丽［9］通过比较相同浓度的柠檬酸、乳酸、乙酸三种有机酸对鱼皮胶原蛋白提取率的影响，发现乙酸提取率最高， 目前国内外已用乙酸从蜥蜴鱼［5］、草鱼［10］、鲶鱼［11］、鳕鱼［12］、鲅鱼［13］、乌贼［14］、金枪鱼［15］等水产动物中提取胶原蛋白， 发现胶原蛋白分子三螺旋结构均未遭到破坏， 说明酸法提取对胶原蛋白的分子结构不会造成影响， 但是酸法提取水产胶原蛋白仍存在提取得率不高、提取速率慢等缺点［8-9］， 需要改进。

酶法提取指利用蛋白酶的特异作用位点来提取胶原蛋白， 所得到的胶原蛋白通常称为酶促溶性胶原蛋白（PSC）， 酶法提取中常用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等， 其中， 胃蛋白酶的应用最为广泛， 因为胃蛋白酶不仅能催化切去胶原蛋白α肽链非螺旋区的端肽， 而且对螺旋区没有作用，提取到的胶原蛋白仍保持完整的三螺旋结构， 降低了胶原蛋白的抗原性， 这为胶原蛋白在生物医药材料中的利用提供了良好的生物基础。笔者所在课题组前期比较了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶对中华鳖裙边中胶原蛋白的提取率［8］， 得出胃蛋白酶的提取得率最高， 且本课题组将此方法用于中华鳖肺组织胶原蛋白的提取［16］。目前， 国内外已用胃蛋白酶从多种水产动物中提取PSC， 如海参［6］、鲟鱼［17-18］、马面鱼［19］、水母［20］、鲷鱼［21］、鲨鱼［22］等， 并且， 在对多种水产动物胶原蛋白提取方法比较之后， 发现酶法提取一般要比酸法提取得率高， 对比如表1所示。

表1 不同水产动物组织提取胶原蛋白的方法比较Tab.1 Extraction methods of different aquatic animal tissues

另外， 为了缩短酶解时间， 加快提取速率， 有学者采用超声波法辅助提取水产胶原蛋白［33］， 因为超声波的空化、湍动、微扰、界面、聚能等效应有力地促进了溶剂向生物材料的渗透和目标物质向溶剂的释放。王林等［34］用超声波辅助酶法从深海红鱼中提取胶原蛋白， 提取时间缩短了30 h， 而且胶原蛋白的结构相较于酶法的单独提取没有差异。

1.2 纯化

目前， 水产动物源胶原蛋白的纯化方法包括盐析法、超滤法、色谱法等， 其中， NaCl盐析法［35］最为常用， 不仅能够有效的纯化胶原蛋白， 而且相对其他纯化方法费用很低； 郑淼［36］采用了硫酸铵分级沉淀的方法对林蛙皮胶原蛋白进行分段盐析， 发现硫酸铵的质量浓度为10%～30%时， 胶原蛋白出现大量沉淀。胶原蛋白盐析后一般采用透析法进行脱盐， 因为盐析后残留的较低浓度盐离子会使胶原蛋白的热变性温度降低［37］， 对胶原蛋白盐析后进行完全脱盐非常必要。但是用透析袋进行盐析除盐速度缓慢、用时较长， 有学者采用超滤方法对三文鱼皮ASC进行脱盐， 超滤7 h即可达到74.4%的脱盐效果［38］。

超滤基于筛分原理即膜孔尺寸的大小对不同大小的物质进行分离、浓缩， 由于其操作环境温和、无相变、无溶剂污染、容易保持生物分子的活性、操作简单可靠等特点， 对于分离热敏性的酶或蛋白质等物质有着独特的优点。石旗红［39］针对海蜇胶原蛋白提取中采用了超滤浓缩纯化工艺， 得到分子质量在10～30Dr的胶原蛋白， 截留率达95%～98%， 获得较高纯度的胶原蛋白， 而且对胶原蛋白粗提液进行超滤也避免了除盐这一环节； 金桂芬［40］也应用了超滤的方法对海蜇胶原蛋白粗提液进行纯化， 研究超滤效果的影响因素并建立了数学模型， 说明超滤对于胶原蛋白的纯化快速、方便、高效。

色谱法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、易于自动化等优点， 利用此方法能够得到更高纯度的胶原蛋白。郑淼［36］在对中国林蛙皮肤胶原蛋白进行一系列的超滤和离子交换层析纯化后， 用凝胶型号G-75对胶原蛋白进行了凝胶过滤层析， 得到了纯度为96.1%的胶原蛋白， 但胶原蛋白的回收率非常低。刘磊等［41］是用CM-52阳离子交换层析对酶法提取的海蜇胶原蛋白做的进一步纯化， 也得到了较高纯度的胶原蛋白。

2 理化性质

2.1 类型及分子质量

目前， 胶原蛋白类型较多， 由于水产胶原蛋白主要是从水产动物组织如皮［14］、骨头［18］、鱼鳞［5］等提取的， 所以主要以Ⅰ型为主， 由胶原蛋白的SDSPAGE图谱得知水产胶原蛋白的分子质量是300 kDa左右， 由三条肽链组成， α1的分子质量为130 kDa， α2的分子质量为110 kDa， 组成形式主要是［α1（Ⅰ）］2α2（Ⅰ）［14-27］，A Veeruraj等［31］发现鳗鱼皮Ⅰ型胶原蛋白是由α1、α2和α3组成的， Senaratne等［42］发现蟾酥皮肤Ⅰ型胶原蛋白是也由α1、α2和α3组成的， 宋瑞瑞［43］从蓝鲨软骨中提取了以［α1（Ⅰ）］3形式组成的Ⅱ型胶原蛋白，Wang等［17］还从史氏鲟皮肤中提取出来了微量的以α1（Ⅴ）α2（Ⅴ）α3（Ⅴ）组成的Ⅴ型胶原蛋白。据研究报道，胶原蛋白的分子质量会受到提取方法的影响［44］， 王忠稳等［45］对草鱼鱼皮和乌鳢鱼皮的ASC和PSC进行了SDS-PAGE类型检测， 与标准Ⅰ型胶原蛋白比较发现， 两种水产动物胶原蛋白均是典型的Ⅰ型胶原蛋白， 以［α1（Ⅰ）］2α2（Ⅰ）形式组成， 但是两种水产动物的ASC分子质量均高于PSC， 这可能与胃蛋白酶能特异的切掉胶原蛋白端肽有关。

2.2 氨基酸组成

水产动物胶原蛋白的氨基酸组成类型与陆生动物的基本保持一致。 其螺旋区的一级结构氨基酸排列形式主要是“Gly-X-Y”， 其中甘氨酸（Gly）含量最高， 约占氨基酸总量的1/3， X、Y 位置为脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp）， 是胶原蛋白的特征氨基酸［1］， Hyp具有很强的吸水性和持水性， 这是胶原蛋白可用于美容护肤的重要因素之一［46］。根据研究， 不同动物中氨基酸比例相差比较大， 尤其是Hyp含量， 一般是陆生动物胶原蛋白中Hyp含量大于水产动物， 而且对于不同种类的水产动物， Hyp含量也是相差较大，其中冷水性鱼类的Hyp含量最低。宋芹等［47］比较了猪皮、牛皮和部分鱼皮、鱼鳞中胶原蛋白中氨基酸的组成及含量， 其中甘氨酸（Gly）、Hyp、Pro和丙氨酸（Ala）含量最高， 鱼类胶原蛋白中Hyp的含量明显低于猪皮和牛皮， 而且典型的冷水性鱼三文鱼鱼皮胶原蛋白中Hyp含量也显著低于温水性鱼鲤鱼鱼鳞中的含量。王林［48］对深海红鱼胶原蛋白进行氨基酸分析发现， 其Hyp含量明显低于温带和热带鱼种来源的胶原蛋白。另外， 胶原蛋白氨基酸组成特别是Hyp含量会受到胶原蛋白提取方法的影响， 但影响不显著。

2.3 光谱分析

利用胶原蛋白的光谱吸收可以灵敏、快速的鉴别其结构、物质组成及相对含量， 通常利用红外光谱对胶原蛋白的二级结构进行鉴定， 观察其是否具有三螺旋结构； 用紫外吸收光谱检测胶原蛋白的最大吸收峰， 既能检测胶原蛋白的含量， 也可以鉴定其纯度。

红外光谱（FIR）区域通常是指波数为4000～200 cm–1的中红外区， 利用红外光在各种波数下透过样品的光的强度不同分析样品中的官能团和氢键，进而证明蛋白质的二级结构。对不同种类的水产动物胶原蛋白进行比较发现， 只要水产胶原蛋白的二级结构没有遭到破坏， 其红外吸收图谱均是相似的，没有显著差异［16-27］， 王忠稳等［45］对草鱼鱼皮胶原蛋白和乌鳢鱼皮胶原蛋白同时进行了红外吸收图谱检测， 发现二者的红外吸收峰几乎是吻合的； 而且来源于同种水产动物的胶原蛋白， 其红外吸收图谱不会受到提取方法的影响， Prabjeet等［11］对鲶鱼皮PSC、ASC的红外吸收图谱进行比较发现二者是相似的， 而且均能保持完整的三螺旋结构。

紫外吸收光谱分析法是根据物质对不同波长的紫外线吸收程度不同而对物质组成进行分析的方法，对于一般蛋白质来说， 在280 nm和200～230 nm有两处吸收峰， 前者是因为蛋白质含有色氨酸（Trp）残基和酪氨酸（Tyr）残基， 分子内部存在着共轭双键， 后者是因肽键存在而引起的， 一般前者用于蛋白质的定量测定。但是胶原蛋白中Trp和Tyr含量甚微或者基本没有。与其他蛋白质不同的是， 胶原蛋白只在200～230 nm处有强吸收， 这一紫外吸收特性可以用来检测胶原蛋白的纯化程度。Yung等［49］比较了蛙皮、鲨鱼皮、牛皮、猪皮中Ⅰ型胶原蛋白的紫外吸收峰， 发现最大吸收峰是在218 nm附近， 在280 nm出均无吸收峰， 可见水产动物和陆生动物胶原蛋白的紫外吸收特征并无差异， 且不同水产动物胶原蛋白之间也没有差异。

2.4 热稳定性

胶原蛋白的热稳定性是指其在特定加热条件下，在一定时间间隔内其结构和粘度等参数的变化， 通常用胶原蛋白溶液热变性温度（Td）和胶原纤维热收缩温度（Ts）来表示其热稳定性。Td是指胶原蛋白增比黏度变为原来50%时所对应的温度， Ts表示使胶原纤维发生突然收缩和卷曲的温度， 即胶原纤维收缩至原来长度的1/3时的温度。目前测定Td和Ts的方法分别主要是采用乌氏粘度法和差示热量扫描法（DSC）。在两种温度下， 胶原蛋白三螺旋结构均被破坏， 氢键在胶原蛋白的三螺旋结构稳定性中起主要作用， 在胶原蛋白热变性过程中发生相应的强度变化， 从而导致胶原蛋白三螺旋结构的改变。

表2 不同水产动物胶原蛋白的氨基酸及热稳定性特点比较Tab.2 Comparison of amino acid and thermal stability of collagen from different aquatic animals

在对多种水产胶原蛋白热稳定性比较之后发现不同水产胶原蛋白热稳定性相差较大， 如表2所示。胶原蛋白的热稳定性是在其进一步的加工利用中重要的影响因素， 如在生物材料中的应用［2］。由表2发现水产胶原蛋白的热变性温度与水产动物栖息的最高环境温度及羟脯氨酸含量呈一定的正相关［50］， 热带性水产动物蓝鲨的软骨胶原蛋白Td为40.6℃［43］，和牛骨胶原蛋白的Td（40.8℃）接近， 高于冷水性水产动物狭鳕鱼［51］胶原蛋白的Td（24.6℃）； 对于同种水产动物， 其胶原蛋白热稳定性也会受到不同的栖息环境影响， 段蕊等［52］对比了夏、冬鲤鱼胶原蛋白的热稳定性， 发现前者优于后者； 而且， 对于同一水产动物不同组织提取的胶原蛋白， 其热稳定性也是有差异的， 黄石溪［10］比较了草鱼鱼鳞、鱼皮、鱼骨胶原蛋白的热稳定性， 发现鱼鳞＜鱼皮＜鱼骨； 另外， 胶原蛋白热变性温度会受到提取方法一定的影响， 但影响不显著， Phanat等［22］测得鲨鱼皮PSC、ASC的Td分别是 34.45℃和 34.52℃， 可见提取方法不会对胶原蛋白的Td造成明显影响。

续表

2.5 微观结构

胶原蛋白溶液在冷冻干燥之后呈多孔结构的海绵状， 本课题组已对从中华鳖裙边提取的胶原蛋白进行显微扫描观察， 证实了这一现象（结果未发表），可为软骨、肌腱、皮肤、神经、血管等不同组织的修复提供具体的三维生长环境［54］， 还可作为药物缓释载体进行定向释放药物［58］。合适的孔径和相连的孔形态能够诱导并决定细胞的生长与分化， 而且胶原蛋白可以通过交联改性等方法来改变孔隙率及孔径大小， 让其能够随着组织个体特殊需要来改变内部孔状结构具有较高的可塑性。詹永献［16］用扫描电镜观察了纯化后冷冻干燥的草鱼鱼鳔胶原蛋白的微观结构， 其在低倍电镜下呈现规则的丝状纤维结构，在高倍电镜下显示为形状不规则并且有联通的孔。Jeong等［59］对金枪鱼鱼骨胶原蛋白进行微观结构扫描发现其不仅具有3D海绵支架结构， 还具有细胞相容性， 能为细胞生长提供体外高度相容性和无毒环境。

3 展望

我国水产资源丰富， 越来越多的水产动物成为获取胶原蛋白的重要来源， 相关应用正在逐渐得到推广， 并且已有相应产品投放市场， 有公司将从鱼皮中提取的胶原蛋白制成止血海绵， 还有各种胶原蛋白粉及胶原蛋白口服液。随着对胶原蛋白微观结构研究的深入， 科学家们正在将胶原蛋白应用到生物材料中。但是， 鉴于目前市场上胶原蛋白及相关制品的价格昂贵， 如何提高水产品胶原蛋白的提取率和纯度是亟需解决的问题。 此外， 如何利用水产胶原蛋白的理化性质和生物学性能使其在进一步加工利用中发挥更大的生物作用， 创造更多的经济价值，也需要深度研究。

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（本文编辑： 康亦兼）

Research progress in extraction， purification， and determination of properties of aquatic collagen

YANG Ya-nan， LI Cai-yan， QIAN Guo-ying
（College of Biological and Environmental Sciences， Zhejiang Wanli University， Ningbo 315100， China）

Jan.， 26， 2015

aquatic collagen； extraction； purification； physical and chemical properties

Collagen is an important functional protein and much attention has been paid to aquatic collagen due to its abundance and unique advantages. In this paper， we review research progress in the extraction， purification and determination of the properties of aquatic collagen. We also consider the prospects for future developments in aquatic collagen research in order to provide a theoretical basis for further applied aquatic collagen research.

Q51

A

1000-3096（2016）01-0138-09

10.11759/hykx20150126001

2015-01-26；

2015-06-10

国家海洋公益性行业科研专项（201405015）； 浙江省公益性技术应用研究计划项目（2014C32072）； 宁波市科技创新团队项目（2012B82016）

杨桠楠（1990-）， 女， 河南开封人， 硕士研究生， 研究方向为水产动物活性物质， 电话： 13932183251， Email： 543192165@qq.com； 李彩燕（1982-）， 通信作者， 女， 副教授， 博士， 电话： 15958293719， Email：licy82@163.com