Poly IC对急性期溃疡性结肠炎小鼠免疫机制的影响

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Poly IC对急性期溃疡性结肠炎小鼠免疫机制的影响

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【摘 要】目的：研究Poly I：C（Polyinosinic-polycytidylic acid）对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠免疫机制调节作用。方法：30只小鼠随机分为正常组（control）、模型组（model）、Poly I：C组（Poly I：C），建立急性溃疡性结肠炎动物模型；观察小鼠疾病活动指数（DAI）、结肠病理学变化、流式细胞术检测T淋巴细胞亚群变化、免疫比浊法检测血清免疫球蛋白变化、免疫组织化学染色测定结肠组织ICAM-1变化；结果：经Poly I：C治疗后模型小鼠的疾病活动指数及病理组织评分明显下降；与model组比较，Poly I：C组免疫细胞反应明显减轻弱，结肠组织ICAM-1蛋白表达明显降低。结论：可见Poly I：C对急性溃疡性结肠炎模型小鼠有免疫调节作用。

【关键词】Poly I：C 溃疡性结肠炎 急性动物模型 免疫细胞 免疫机制

作者单位： 1.河北省人民医院 河北 050051

2.邯郸市永年县第一医院 河北 057150

2015-12-13收稿，2016-02-03修回

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是一种高复发的肠道炎症性疾病，研究结果表明，UC是一种免疫反应介导并与遗传、环境因素密切相关的疾病。Poly I:C（Polyinosinic-polycytidylic acid）在研究中被广泛用于TLR3（Toll-like receptor 3）的激活剂，是一种有效的免疫调节剂，可诱导I型干扰素，增强机体初期抗体应答，形成长期的免疫记忆［1］。我们通过对急性期UC模型小鼠的治疗，进一步探讨Poly I:C在治疗UC免疫机制方面的调节作用。

1　材料与方法

1.1试剂与动物造模 右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）（Sigma公司 美国）；Poly I:C（Sigma公司 美国）；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM（四川迈克科技有限责任公司）；抗兔-ICAM-1（北京博奥森生物技术有限公司）；CD3+、CD4+、CD8+抗体（美国Beckmen Coulter公司）；急性期造模及Poly I:C干预：30只雄性C57BL/6小鼠（体重19～21g；8～11周），购于北京维通利华实验动物技术有限公司；按随机数字表随机分入正常组、模型组和Poly I:C组，每组10只；模型组自由饮用2% DSS 7天，正常组和Poly I: C组小鼠自由饮用蒸馏水7天；Poly I:C组指在造模前2小时给予0.3mg/kg Poly I:C—次性肌肉注射给药，空白组和模型组同时给予生理盐水同等剂量肌肉注射作为对照，时间均为1周，从第8天处死所有动物。

1.2结肠病理组织染色 每天观察小鼠的体重、食欲、精神状态、活动情况及毛色光滑度等。在实验结束时处死小鼠，取部分肠段置于多聚甲醛内固定，包埋、切片，HE染色，行组织病理学观察。

1.3检测T细胞亚群及免疫球蛋白变化 处死动物后取血（EDTA抗凝）后，加入FITC标记的抗小鼠CD3+、CD4+、CD8+抗体，用流式细胞仪荧光法检测；应用免疫比浊法检测血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的含量。

1.4结肠组织免疫组织化学染色 结肠组织石蜡切片，脱水，脱蜡，抗原修复，封闭，一抗ICAM-1在37℃孵育1.5h，PBS洗片5次，二抗37℃孵育30 min，PBS洗片3次，光镜下观察结肠组织ICAM-1蛋白的表达情况。

1.5统计学方法 利用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据均以均数±标准差± s）表示。组间比较采用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

2.1动物的一般状况 实验期间，正常组小鼠大小便及饮食均正常、体重持续增加、毛发有光泽，活动自如、精神状态良好。急性期模型组动物饮用2%DSS水后第1天，体重、饮水、进食均无明显变化；饮用2%DSS第3天，开始食量、体重均下降，肛门处有黏液血便，精神萎靡，懒于活动，被毛松散无泽；实验第8天模型组小鼠体重明显减轻，肛周仍可见肉眼血便，粪便潜血试验仍有阳性。Poly I:C组第5～7天后仍有稀便，但未见脓血便，状态接近正常，但体重与正常组比较仍明显减轻。

2.2Poly I:C对小鼠结肠组织病理学变化的影响 正常组肠黏膜光滑，无水肿、充血等表现；模型组结肠黏膜缺损可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量炎性细胞浸润。予Poly I:C干预后小鼠结肠病理较模型组明显改善。

2.3Poly I:C对小鼠T细胞亚群变化的影响 与模型组比较，Poly I:C组均能明显降低小鼠血清中CD4+的含量（P＜0.01），Poly I:C组与模型组比较，能明显升高CD8+的含量（P＜0.01）；经Poly I:C治疗后，与模型组比较，其可降低CD4+/CD8+的含量（P＜0.01）。见表1。

表1　T细胞亚群检测（%）（±s）

表1　T细胞亚群检测（%）（±s）

注：与模型组比较⋆P＜0.01；与Poly I：C组比较▲P＜0.01

组别　　只　CD3+　CD4+　CD8+　CD4+/CD8+Poly I：C组　10　50.48±4.35⋆　28.24±4.40⋆　27.80±7.29⋆　1.002±0.254⋆模型组　10　63.98±2.54▲　48.03±3.37▲　14.69±3.45▲　3.020±0.224▲空白组　10　46.98±3.48⋆　23.18±4.42⋆　28.65±6.80⋆　0.891±0.191⋆

2.4Poly I:C对小鼠免疫球蛋白的影响 与模型组比较，Poly I:C能明显降低血中IgA的含量（P＜0.01）；Poly I:C组与模型组比较能降低血中IgG的含量（P＜0.01），经Poly I:C治疗后，与模型组比较，其可明显降低血中的IgM，与模型组比较有显著性（P＜0.01）。见表2。

表2　免疫球蛋白检测（u/L）（±s）

表2　免疫球蛋白检测（u/L）（±s）

注：与模型组比较⋆P＜0.01；与Poly I：C组比较▲P＜0.01

组别　只　IgA　IgG　IgM Poly I：C组10 0.033±0.017⋆0.200±0.068⋆0.265±0.056⋆模型组　10 0.085±0.024▲0.386±0.066▲0.303±0.070▲空白组　10 0.030±0.022⋆0.165±0.082⋆0.189±0.066⋆

2.5Poly I:C对小鼠结肠组织黏附分子（ICAM-1）蛋白表达水平的影响 本实验对各组小鼠结肠组织行ICAM-1免疫组织化学染色，我们可以看见模型组结肠组织细胞ICAM-1染色蛋白表达明显高于正常组；但经过Poly I: C治疗后与模型组比较ICAM-1细胞蛋白染色明显减弱。

3　讨 论

UC是一种非特异性炎症性疾病，近年研究资料表明，UC的发病率在国内外均有增高的趋势，尽管本病的发病机制尚不清楚，但免疫异常反应在该病发病中的作用已毋庸置疑。近年来研究结果显示免疫功能紊乱在UC发生发展中起重要作用，尤其是T淋巴细胞是免疫反应中抗原递呈的核心环节，目前有两个主要的T细胞亚群，即CD4细胞（辅助性/诱导性T细胞；Th/Ti）和CD8细胞（抑制性/细胞毒性T细胞；Ts/Tc），是免疫调节的枢纽，控制着免疫应答的强度。

实验研究结果表明， Poly I:C组对异常增高的IgA、IgG有明显的抑制作用，本研究说明该药治疗UC的机制与有效调节异常免疫反应有关。许多研究已证实，在正常肠黏膜中ICAM-1通常在毛细血管、微静脉和大血管内皮细胞低水平表达；在UC中，ICAM-1在结肠组织中的分布和表达都明显增加，在机体免疫过程中起重要作用，使人们认识到直接针对ICAM-1的治疗可能成为一种新的手段。通过本实验研究表明，UC模型组小鼠结肠组织行免疫组织化学染色可见ICAM-1阳性细胞染色明显增多，经Poly I:C干预后结肠组织中ICAM-1阳性细胞的染色明显减弱，可见Poly I:C在急性期UC模型小鼠的机体免疫过程中起重要作用，为临床上UC治疗提供理论依据。

参考文献

1 Das A，Chai JC，Kim SH，et al.Transcriptome sequencing of microglial cells stimulated with TLR3 and TLR4 ligands［J］.BMC Genomics，2015，16：517～538.

（编审：苏春雨 施仲赋）

The effects of Poly IC on the immunologic mechanism in the acute experimental colitis

1.Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，Hebei

ZHAO Hong-wei1，ZHAO Fang-xia2，ZHANG Jing1，et al

Key Words:Poly I:C；Ulcerative colitis；Acute experimental colitis；Immunologic cells；Immunologic mechanism

Abstract:Objective:To investigate the effects of Poly IC on the immunologic mechanism in DSS-induced acute colitis.Method:Thirty of mice were randomly grouped as follows: control group， model group， Poly IC group， acute colitis were established， disease activity index （DAI） and colon pathological changes were observed，the changes of T lymphocyte subsets and immunoglobulin were detected by Flow cytometry and Immune turbidimetry， the expressions of ICAM-1 proteins were detected by immunohistochemistry，Results:The DAI and colon pathological were changed in the Poly I:C group compared with that of the model group； Immunologic cells were decreased， the proteins expressions of ICAM-1 significantly decreased in the Poly I:C group compared with that of the model group by immunohistochemical staining.Conclusions:The administration of PolyI:C may be adjusted the immunologic mechanism in the acute experimental colitis.

【中图分类号】R574.62

【文献标识码】A

【文章编号】1671-8054（2016）02-0069-02

作者简介：赵红伟，女，博士研究生，主治医师