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减毒李斯特菌载体运送HPV16 E7基因重组疫苗的构建及其生物学特性

2016-07-04贾艳艳殷月兰谈卫军段斐斐潘志明陈祥焦新安

生物工程学报 2016年5期
关键词:李斯特毒力结果显示

贾艳艳,殷月兰,谈卫军,段斐斐,潘志明,陈祥,焦新安

扬州大学 江苏省人兽共患病重点实验室 江苏省动物重要疫病和人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009



减毒李斯特菌载体运送HPV16 E7基因重组疫苗的构建及其生物学特性

贾艳艳,殷月兰,谈卫军,段斐斐,潘志明,陈祥,焦新安

扬州大学 江苏省人兽共患病重点实验室 江苏省动物重要疫病和人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009

贾艳艳, 殷月兰, 谈卫军, 等. 减毒李斯特菌载体运送HPV16 E7基因重组疫苗的构建及其生物学特性. 生物工程学报, 2016, 32(5): 683–692.

Jia YY, Yin YL, Tan WJ, et al. Construction and characterization of an attenuated recombinant Listeria monocytogenes vector vaccine delivering HPV16 E7. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 683–692.

摘 要:单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes, LM) 是一种理想的肿瘤疫苗载体,本文旨在构建表达人乳头瘤状病毒 (HPV) 16型 E7蛋白的减毒重组李斯特菌疫苗候选株并分析其生物学特性。利用同源重组技术将HPV16 E7基因定点整合至LM hly基因信号肽序列下游,获得减毒重组李斯特菌LM4△hly::E7,并对该重组菌进行生物学特性研究。实验结果表明,重组菌能够分泌表达具有免疫学活性的E7-LLO融合蛋白,大小约66 kDa;通过激光共聚焦扫描显微镜观察到重组菌能够在RAW264.7细胞胞内增殖。ELISA测定结果显示减毒重组菌能够诱导小鼠产生E7特异性抗体。重组菌在C57BL/6小鼠中LD50为3.863×109CFU,低于亲本株4个数量级,通过组织切片观察到重组菌对小鼠肝脏及脾脏无明显病理变化。以上表明,本研究构建的分泌表达E7-LLO融合蛋白的减毒重组李斯特菌具有较好的安全性,为下一步研究其抗肿瘤作用提供了材料,并为研发宫颈癌的免疫治疗型候选疫苗奠定重要基础。

关键词:减毒单核细胞增生李斯特菌,人乳头瘤状病毒16型 E7蛋白,巨噬细胞系,安全性

Received: September 29, 2015; Accepted: December 21, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31472193, 31101841), Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

国家自然科学基金 (Nos. 31472193, 31101841),江苏高校优势学科建设工程项目资助。

宫颈癌位居女性癌症死亡率中的第2位,是重要的公共健康问题[1]。中国是宫颈癌的高发国之一,每年有13.5万人被诊断为宫颈癌,占全世界每年宫颈癌病例的1/3[2-3]。目前已经证实人乳头瘤状病毒 (HPV) 是引起宫颈癌的主要病原,而HPV的E6、E7蛋白特异性存在于癌细胞中,是维持细胞转化和恶性特征所必需的,常被作为宫颈癌免疫治疗的靶基因[4-5]。

单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes, LM) 是一种革兰氏阳性、兼性胞内寄生菌[6],一般经过消化道感染,然后通过肠上皮细胞散播至全身[7]。LM被吞噬细胞吞噬后,在吞噬体内LM分泌毒力因子溶血素 (Listeriolysin O, LLO) 及磷脂酶C裂解吞噬体膜,进而逃脱至细胞胞浆。这种独特胞内生活史使LM能够诱导强烈的CD8+T细胞免疫和CD4+T细胞免疫应答[8]。目前,利用LM诱导强烈的T细胞免疫应答特性,李斯特菌已试用于传染性疾病和肿瘤疾病疫苗载体的研发[9-11]。

基于此,本研究拟以LM4为材料,利用穿梭载体pKSV7将HPV16 E7抗原定点整合至LM4的基因组hly基因信号肽序列下游,获得分泌表达LLO-E7融合蛋白的重组减毒李斯特菌,并对其生物学特性进行研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要菌株及载体

野生型菌株LM4 (血清型1/2a) 及LM4△hly::esat-6,RAW264.7细胞、宿主菌E. coli DH5α、穿梭载体pKSV7 (Ampr) 及pNF8 (ermr,gfp-mut1)、GST-E7融合蛋白均由江苏省人兽共患病学重点试验室保存;pcDNA3.1-E7由扬州大学医学院高慧老师惠赠;pMD 18-T载体购自TaKaRa公司。

1.1.2主要仪器

普通摇床SCS 24购自上海市离心机械研究所;隔水式电热恒温培养箱购自上海跃进医疗器械厂;PCR仪购自东胜创新生物科技有限公司;台式冷冻小离心机FRESCO 21购自Thermo公司;超声波裂解仪购自SONICS & MATERIALS公司;蛋白质电泳仪、凝胶成像系统购自Bio-Rad公司;转印仪购自Amer Sham公司;Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge 5810R购自eppendorf公司。

1.1.3主要试剂

细菌基因组DNA抽提纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA回收试剂盒及限制性核酸内切酶、DNA Marker、X-Gal及IPTG购自大连宝生物 (TaKaRa) 公司;T4 DNA连接酶购自Promega公司;氨苄青霉素 (Amp)、氯霉素购自华美公司;BHI 培养基 (BactoTMbrain heart infusion) 购自BD公司;过硫酸铵 (AP)、Tris、十二烷基磺酸钠 (SDS)、三氯乙酸 (TCA) 购自上海国药集团;羊抗鼠IgG-HRP购自Sigma公司及HPV16 E7鼠单克隆抗体 (clone 8C9) 购自Invitrogen公司。

1.1.4实验动物

6周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠购自扬州大学比较医学中心。

1.2引物设计

参照GenBank上公布的基因序列设计引物,由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.3重组菌LM4△hly::E7的构建

1.3.1hly a、hly b及HPV16 E7基因的PCR扩增及拼接

参照细菌基因组抽提试剂盒说明抽提LM4基因组DNA,以LM4基因组DNA为模板,分别扩增上下游同源臂hly a及hly b;以pcDNA3.1-E7为模板,扩增E7片段。

表1 实验所用引物Table 1 Primer pairs used to amplify related genes

利用重叠延伸PCR (SOEing PCR) 将hly a、E7及hly b拼接成a-E7-b,按照DNA凝胶回收试剂盒程序回收a-E7-b片段,连接至pMD18-T载体,鉴定正确的pMD18-T-aEb克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.3.2pKSV7-aEb的构建

pMD18-T-aEb及pKSV7经过KpnⅠ、XbaⅠ双酶切消化后,分别回收酶切产物,置16 ℃连接过夜,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒pKSV7-aEb,酶切鉴定正确的重组质粒用于重组李斯特菌的构建。

1.3.3电转化

用电转化方法将重组质粒pKSV7-aEb导入感受态LM4中,通过温度和氯霉素抗性压力下实现同源重组,最终将目的抗原E7定点整合至LM4的hly启动子下游,同时实现hly毒力区42 bp片段的缺失[12],获得在氯霉素抗性下不能生长且经PCR及RT-PCR鉴定正确的重组菌LM4△hly::E7。

1.4Western blotting分析

采用TCA方法提取重组菌分泌蛋白,将分泌蛋白进行SDS-PAGE电泳,然后电转印至NC膜,1% BSA的PBST溶液封闭过夜,次日,与HPV16 E7鼠单克隆抗体在37 ℃孵育2−3 h,然后用HRP标记的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h,ECL显色。

1.5重组菌LM4△hly::E7在巨噬细胞中的增殖

将pNF8 (ermr,gfp-mut1) 电转化至感受态LM4△hly::E7,构建表达GFP的重组菌LM4△hly::E7 (pNF8)。参照殷月兰等的方法[13],将LM4△hly::E7 (pNF8) 以MOI为20∶1 (细菌数∶细胞数)感染RAW264.7巨噬细胞;取培养3 h和5 h后的细胞爬片进行固定、鬼壁环肽染色,最终利用激光共聚焦扫描显微镜观察LM4△hly::E7 (pNF8) 在巨噬细胞中的侵袭与增殖情况。

1.6生长曲线的测定

将LM4、LM4△hly::E7接种于BHI培养基中振摇培养12−14 h,然后取1 mL菌液用PBS洗涤2次,取适当体积菌液接种至5 mL BHI培养基中调整OD600值至0.05,放置在37 ℃振摇培养,分别在0 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6.5 h、8 h、9.5 h、10.5 h及22.5 h等时间点后取出2支菌液,测定其OD600值,绘制其生长曲线。

1.7溶血活性的测定

LM4、LM4△hly::E7在BHI培养基中37℃培养15 h后,菌液离心后取上清,用PBS调整OD600至相同大小,取70 μL上清液加至96孔V型板中,用PBS从原液到27系列倍比稀释,然后每孔加入30 μL 1%绵羊红细胞,微振荡混匀,96孔V型板放置37 ℃培养箱,1 h后观察溶血情况。

1.8重组菌对C57BL/6小鼠的LD50测定

将过夜培养物按1∶20转接BHI培养基,37 ℃培养4 h后,用PBS洗涤,测定其OD600并调整至所需大小。将6周龄C57BL/6小鼠随机分成5组,每组5只,腹腔注射,每只小鼠注射剂量为100 μL,呈倍数递减。观察2周,记录小鼠死亡情况,并采用Reed-Muench方法计算重组菌对C57BL/6小鼠的半数致死量[14]。

1.9免疫鼠脏器的组织切片观察

6−8周龄 C57BL/6雌性小鼠,随机分为2组,每组3只,在0 d、7 d,分别腹腔注射LM4△hly::E7、LM4 (注射剂量为0.1 LD50) 和PBS,于2次免疫后7 d取小鼠的脾脏、肝脏用13%甲醛固定,用于组织切片的制作,分析组织的显微变化。

1.10ELISA检测免疫鼠血清中的E7特异性抗体

免疫后7 d,无菌采集分离小鼠血清以GST-E7融合蛋白为检测抗原,应用间接ELISA方法测定免疫组的E7抗体效价。

1.11数据分析

应用SPSS16.0软件对试验数据进行方差分析及卡方检验;应用GraphPad Prism 5.0软件作图。

2 结果与分析

2.1重组菌LM4△hly::E7的构建

2.1.1hlya-E7-b片段的PCR扩增

采用PCR扩增出hly a、hly b、HPV16 E7 等3个基因片段,电泳结果显示产物大小分别为525 bp、291 bp及730 bp,与预期结果相符合。通过2次SOEing PCR扩增,将hly a、E7、hly b拼接成hlya-E-b,电泳结果显示PCR产物大小为1 586 bp,与预期相符。

2.1.2pKSV7-hlya-E-b的构建及鉴定

将hlya-E-b拼接片段连接至pMD-18T载体,将鉴定正确的重组质粒pMD-18T-aEb与pKSV7经过KpnⅠ、XbaⅠ双酶切消化后,连接转化。抽提重组质粒,进行PCR鉴定,电泳结果显示出PCR产物为1 586 bp,然后经过双酶切鉴定,产物呈现出6 900 bp和1 586 bp两条带,与预期相符 (图1),说明重组质粒构建成功,命名为pKSV7-hlya-E-b。

2.1.3重组菌LM4△hly::E7的鉴定及Western blotting分析

图1 重组质粒pKSV7-hlya-E-b的PCR鉴定及酶切鉴定Fig. 1 Identification results of pKSV7-hlya-E-b using PCR and enzyme digestion assay. M: λ-T14; Lane 1: pKSV7-hly a-E-b digested with KpnⅠ and XbaⅠ; Lane 2: PCR product of pKSV7-hly a-E-b.

图2 LM4△hly::E7的PCR鉴定Fig. 2 PCR identification results of LM4△hly::E7 (primer hly a1/hly b+). M: DL2 000. 1: amplified product of LM4△hly::E7; 2: amplified product of wild type LM4; 3: amplified product of pKSV7-hly aEb.

将重组质粒pKSV7-hlya-E-b电转化至LM4感受态中,经过同源重组将E7片段定点整合至hly的启动子下游得到重组菌,然后利用hly a上游引物与hly b下游区外侧设计的一条引物hlyb+进行PCR扩增,鉴定结果显示重组菌的扩增片段为1 700 bp,亲本株LM4的扩增片段为1 450 bp,pKSV7-hlya-E-b无任何扩增片段,且经测序证明,与LM4的扩增片段相比,重组菌的1 700 bp扩增片段中增加了E7基因序列,少了42 bp的hly毒力区,由此说明减毒重组菌构建成功并命名为LM4△hly::E7。

提取重组菌LM4△hly::E7的分泌蛋白进行Western blotting分析,结果显示利用HPV16 E7单抗检测到在66 kDa左右处有一条清晰的浓染带,与预期相符 (图3),表明LM4△hly::E7能够分泌表达具有良好免疫反应性的HPV16 E7蛋白。

2.2重组菌LM4△hly::E7 (pNF8) 在巨噬细胞中的增殖试验

为了检测重组菌LM4△hly::E7在巨噬细胞中的增殖情况,构建了表达GFP的重组菌LM4△hly::E7 (pNF8),LM4△hly::E7 (pNF8) 感染RAW264.7细胞后,激光共聚焦扫描显微镜观察到感染3 h时,RAW264.7细胞胞内有少量的发绿色荧光重组菌,而感染5 h时胞内出现了大量绿色荧光的重组菌 (图4)。

图3 LM4△hly::E7的Western blotting分析Fig. 3 Western blotting analysis of proteins secreted by LM4△hly::E7. M: protein marker; 1: LM4△hly::E7; 2: wt LM4.

图4 LM4△hly::E7(pNF8)在巨噬细胞RAW264.7中的增殖Fig. 4 Intracellular localization of LM4△hly::E7(pNF8) strain in RAW264.7 cells (1 000×).

2.3重组菌LM4△hly::E7的生长曲线测定

LM4△hly::E7、LM4的生长曲线见图5,从图中可以看出LM4△hly::E7与LM4的生长曲线基本一致,均表现为培养1 h至7 h期间,细菌进入快速增长期,7–9 h时,细菌增殖进入稳定期。

2.4重组菌LM4△hly::E7的溶血性试验

通过溶血性实验,显示出重组菌LM4△hly::E7的溶血效价为23,野生型细菌LM4的溶血效价为24(图6),表明E7插入LM4 的hly下游并未导致LLO的完全失活。

图5 重组菌LM4△hly::E7的生长曲线Fig. 5 Growth curve of LM4△hly::E7 strain.

图6 溶血性试验Fig. 6 Haemolytic activities of LM4 and LM4△hly::E7 strains.

2.5重组菌LM4△hly::E7的LD50测定

小鼠死亡情况见表2,通过Reed-Muench法计算重组菌LM4△hly::E7的LD50为3.863×109CFU,而LM4的LD50为1.06×105CFU,结果显示重组菌LM4△hly::E7的LD50高于野生菌LM4的4个数量级。

2.6组织切片观察结果

通过组织切片观察到LM4腹腔感染小鼠的肝脏呈现肝细胞肿胀,水泡变性,肝窦狭窄甚至闭塞,细胞浆有大小不等的水泡;脾脏结构模糊,巨噬细胞浸润。重组菌LM4△hly::E7以高于LM4 105倍的细菌量感染小鼠后,小鼠肝脏仅表现出轻微的炎症反应,少量炎性细胞浸润,脾脏无明显病理变化 (图7)。

2.7血清中E7抗体检测结果

利用ELISA方法检测各免疫组小鼠血清中E7抗体水平,图8显示LM4△hly::E7免疫组小鼠血清中E7抗体效价为1∶400,试验结果表明构建的重组李斯特菌能够诱导机体产生E7特异性的体液免疫应答。

3 讨论

表2 LM菌株对C57BL/6小鼠的LD50测定Table 2 LD50of LM strains for C57BL/6 mice

图7 不同免疫组的脾脏及肝脏组织切片Fig. 7 Spleen and liver tissue sections from mice in different groups (400×).

图8 不同免疫组血清中的E7抗体水平Fig. 8 Serum antibodies against E7 antigen in different regimens.

目前,重组李斯特菌疫苗用于癌症免疫治疗成为众学者的研究方向之一[15-17],其采用的构建方式多数是应用质粒互补系统[18-20],构建的重组菌需要抗生素的维持,并存在质粒被脱掉的隐患。因此,本研究利用穿梭载体pKSV7通过同源重组技术将HPV16 E7抗原整合至LM4基因组内,在无压力条件下传代脱掉质粒,进行筛选重组菌时,首先选择在BHI平板生长,而在BHIcm+不生长的细菌,然后在hly b下游区的外侧设计一条引物,通过PCR扩增鉴定外源抗原是否整合至基因组及质粒是否完全脱掉,最终获得稳定分泌表达HPV16 E7抗原的重组菌株,该减毒重组菌不需要抗生素的维持,安全性好,在临床应用上更有优势。

LLO是一类胆固醇依赖的孔形成素,单增李斯特菌的重要毒力蛋白[21],是维持LM逃脱吞噬体进入胞浆及诱导MHCⅠ类抗原提呈途径所必需的[22-23]。同时研究表明,LLO蛋白能够增强肿瘤抗原的免疫原性,增加肿瘤特异性CD8+T细胞产生的数量,有助于疫苗以CD8+T细胞免疫应答方式消除肿瘤,在肿瘤疫苗研发中具有很好的佐剂效应[24-25]。因此,在构建重组李斯特菌时,将E7基因定点插入至hly基因的信号肽下游,以期获得分泌表达E7-LLO融合蛋白的重组菌,提取减毒重组菌的分泌型蛋白进行Western blotting分析,结果显示减毒重组菌能够分泌表达具有免疫学活性的E7-LLO蛋白,为减毒重组菌发挥抗肿瘤作用奠定重要基础。

考虑到疫苗的安全性,我们在构建重组菌的同时,缺失了LLO部分毒力区,LD50测定结果显示重组菌的毒力比亲本株LM4显著下降,且通过组织切片观察到重组菌对小鼠肝脏及脾脏无明显病理变化,安全性较高。而溶血性试验表明E7的插入及LLO部分毒力区的缺失并未导致LM4△hly::E7中LLO活性的完全丧失,激光共聚焦扫描显微镜观察到重组菌能够在RAW264.7细胞内增殖,这为重组菌诱导CD8+T细胞免疫应答奠定基础。

生长曲线测定结果显示重组菌和野生型细菌无显著差别,表明外源抗原E7插入LM4基因组内,没有造成细菌的代谢负担,也没有改变细菌的正常生长规律。此外,对重组菌进行连续传代,利用RT-PCR技术能够检测到第30代重组菌中E7的表达 (另文发表),表明该重组菌具有较好的遗传稳定性。同时血清抗体检测结果显示构建的减毒重组李斯特菌能够诱导小鼠产生E7特异性的体液免疫应答。

本研究成功地构建了表达E7蛋白的减毒重组李斯特菌,并对其溶血活性、毒力及体液免疫应答等特性进行了分析,结果显示该减毒重组菌分泌表达具有良好免疫学活性的E7-LLO融合蛋白,毒力比亲本株显著降低,安全性好,且能够诱导特异性抗体的产生,这为后续抗肿瘤研究提供了重要的生物材料,为宫颈癌候选疫苗的研发提供了新思路。

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(本文责编 陈宏宇)

生物技术与方法

Construction and characterization of an attenuated recombinant Listeria monocytogenes vector vaccine delivering HPV16 E7

Yanyan Jia, Yuelan Yin, Weijun Tan, Feifei Duan, Zhiming Pan, Xiang Chen, and Xin′an Jiao
Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Abstract:Listeria monocytogenes (L. monocytogenes, LM) is an excellent tumor vaccine vector. In this study, recombinant LM vaccine candidate expressing human papillomavirus type 16 (HPV16) E7 protein was constructed and its charactericts were determined. Through homologous recombination, E7 gene was cloned in frame with the LM4 Phly promoter-signal sequence, and introduced into the chromosome of LM4. The recombinant strain named LM4△hly::E7 with the plasmid-free and antibiotic-resistant gene-free was constructed. LM4△hly::E7 could express and secrete E7-LLO fusion protein; its size is 66 kDa and has immunological activity. Furthermore, LM4△hly::E7 could multiply in RAW264.7 macrophages by confocal laser scanning microscope. Additionally, LM4△hly::E7 could induce specific antibodies against E7 in immunized mice in ELISA. Also, the 50% lethal dose (LD50) of LM4△hly::E7 strain was 3.863×109CFU (Colony-Forming Units) in C57BL/6 mice with intraperitoneal immunization, which was more attenuated than wild type LM4. Mice immunized with LM4△hly::E7 did not show obvious pathological change. These data show that LM4△hly::E7 expressing E7-LLO fusion protein has good safety, which may provide the materials for research of antitumor effect and would be a promising vaccine candidate for cervical cancer.

Keywords:attenuated Listeria monocytogenes, HPV16 E7, macrophage cell line, safety

Corresponding author:Xin′an Jiao. Tel: +86-514-87971136; Fax: +86-514-87311374; E-mail: jiao@yzu.edu.cn

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