鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵生产L－乳酸的工艺优化

张强，薄 惠，邢建华，王高峰

（黄河科技学院医学院实验中心，河南郑州450063）

鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵生产L－乳酸的工艺优化

张强，薄 惠，邢建华，王高峰

（黄河科技学院医学院实验中心，河南郑州450063）

为提高鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵生产L－乳酸的产量，采用单因素和正交试验对L－乳酸发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明：ZQ－55发酵生产L－乳酸的最佳培养基组成为葡萄糖16g／100mL、蛋白胨0.25g／100mL、酵母粉1.0g／100mL、乙酸钠0.3g／100mL、K2HPO40.1g／100mL、吐温－80 0.1g／100mL、MgSO4·7H2O 0.02g／100mL、MnSO4·H2O 0.05g／100mL。最适发酵条件为发酵时间72h，接种量10%，温度37℃，转速150r／min，装液量为100mL，一次性添加碳酸钙10g。以该培养基为最适L－乳酸发酵培养基和发酵条件进行发酵，在摇瓶水平上的L－乳酸产量为120g／L。进行5L发酵罐上罐发酵生产L－乳酸，产量为160.5g／L，产L－乳酸速率为2.23g／（L·h），葡萄糖的总添加量为187g／L，糖转化为L－乳酸的转化率为85.56%，L－乳酸的光学纯度为95.39%。

鼠李糖乳杆菌；发酵；L－乳酸；优化

乳酸按其旋光性可分为D－乳酸、L－乳酸和DL－乳酸，是一种重要的有机酸［1－2］。广泛应用于医药、食品和环保等行业［3］。L－乳酸（L－lactic acid）是一种重要的医药中间体，可用于生产红霉素林格氏液用于输液。其中，L乳酸钙、L乳酸钠、L乳酸锌和L乳酸亚铁等药物是补充金属元素的良好药品［4］。同时，L－乳酸还可用作手术室、病房和实验室等杀菌消毒［4］。由于人体只能利用L－乳酸，且我国在L－乳酸的产量和质量上不能满足市场日益增长的需求，产品多为消旋的DL－乳酸，因此研究生产L－乳酸替代D－乳酸和DL－乳酸有着现实的意义和应用前景［5－7］。

张为巍等［8］对筛选得到的野生型鼠李糖乳杆菌CLRID10通过响应面试验优化后的L－乳酸产量达104.40g／L，吴晖等［9］通过正交试验优化后的L－乳酸产量达143.6g／L，但其研究均是在摇瓶水平上进行，没有通过发酵罐放大进行L－乳酸发酵的参数优化，也没有对L－乳酸的光学纯度进行分析。为此，笔者对野生型的鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵生产L－乳酸的培养基和发酵条件进行优化，并对发酵罐放大和L－乳酸光学纯度进行分析，以期为L－乳酸的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）ZQ－55由黄河科技学院医学实验中心筛选、选育并保藏。

1.1.2 试剂 葡萄糖、碳酸钙、吐温－80、乙酸钠、磷酸氢二钾、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O等试剂均为分析纯（国药集团），蛋白胨、酵母粉（英国OXOID公司），MRS肉汤（青岛高科园海博生物技术有限公司），L－乳酸（山东省农业科学院）。

1.1.3 仪器DU730型紫外分光光度计（美国Beckman公司），ZHWY－1102C双层小容量恒温摇床（上海智诚公司），SW－CJ－1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），电热恒温培养箱（天津市中环实验电炉有限公司），SBA－40D生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所），BLBIO－5SJA型5L自动发酵罐（上海百伦科技），GSP－9080MBE型隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 菌种培养

将甘油管内的菌种溶解后接入100mL的MRS液体培养基中，37℃恒温过夜培养活化后，接种至100mL装液量的L－乳酸发酵培养基中，37℃、150r／min恒温震荡培养。

1.3 单因素试验考察

单因素试验时，依次改变K2HPO4的添加量（0.1g／L、0.2g／L、0.3g／L、0.4g／L和0.5g／L）、不同的初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、不同的接种量（2.5mL／100mL、5.0mL／100mL、7.5mL／100mL、10.0mL／100mL、12.5mL／100mL、15.0mL／100mL、17.5mL／100mL和20.0mL／100mL）、不同的发酵时间（1d、2d、3d、4d、5d、6d 和7d）以及不同的中和剂（氢氧化钙、碳酸钙、氨水和碳酸氢钠），以L－乳酸产量为评价指标，所有的梯度都设置3个平行的摇瓶试验，然后取其平均值作为试验测定结果。

1.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上，通过4因素3水平的正交试验［10－11］，考察L－乳酸发酵培养基中葡萄糖、乙酸钠、蛋白胨和酵母粉确定各组分的最佳用量，试验设计的因素及水平见表1。以优化后的最佳L－乳酸发酵培养基为基础，在5L发酵罐发酵生产L－乳酸的过程中，每隔2h取样1次，分别测定残糖量、L－乳酸产量和菌体OD600值，发酵72h结束。

表1 鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵产L－乳酸的正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels in orthogonal test of L.rhamnosus ZQ－55producing L－lactic acid g／100mL

1.5 菌体OD值的测定

移取100μL发酵液稀释至500倍，通过利用紫外分光光度计在600nm处测定菌体吸光度值。菌体的OD600值为OD600×稀释倍数。

1.6 L－乳酸的测定与分析

取100μL的发酵液稀释至400倍，8 000r／min离心1min，利用生物传感分析仪测定L－乳酸的产量。乳酸的光学纯度采用手性分离色谱柱，通过高效液相色谱法测定。首先移取150μL的L－乳酸发酵液稀释至100倍，然后用0.22μm滤膜过滤，L－乳酸光学纯度的分析测定条件设定：Chiralpak AD型手性异构分离柱，流动相为2mmol／L CuSO45%异丙醇，流速为1mL／min，紫外检测波长为236nm，柱温为30℃［12］。

1.7 5L发酵罐试验

以优化的最佳发酵培养基配置5L发酵罐的初始发酵培养基，发酵罐中的发酵液初始装液量为2.5L。初始葡萄糖浓度为160g／L，发酵到50h时添加140g质量分数为50%的葡萄糖溶液，pH用50%的NaOH溶液调节，pH调节采用发酵罐自动控制，低于4.5时自动添加碱以调节pH，吐温－80作为缓冲剂时，要添加消泡剂，发酵过程中通高纯氮气，以保证严格厌氧发酵。

1.8 数据统计分析

所有的试验都进行3次重复，然后取其平均值作为测定结果值，平均值和标准偏差分析用Microsoft Excel 2007软件处理。图形的绘制由Origin 7.5进行统计分析数据后完成。

2 结果与分析

2.1 不同因素下L－乳酸的产量

从图1可知，不同发酵时间、接种量、初始pH、中和剂及K2HPO4添加量的L－乳酸产量变化。

2.1.1 发酵时间 发酵时间低于3d时，L－乳酸的产量随着发酵时间的延长而不断增加，当发酵时间超过3d时，L－乳酸的产量随着发酵时间的延长而降低。可能是发酵培养时间过长时，菌体死亡率加大，导致微生物代谢能力降低，也可能是发酵时间过长，发酵液中的营养物质已接近消耗殆尽［13］，这时菌体利用代谢产物L－乳酸来维持基本生命的活动，最终导致L－乳酸产量降低。

2.1.2 接种量L－乳酸产量随着接种量的增加而增加，当达到10mL时L－乳酸产量最大，为136g／L，而后随着接种量的增加L－乳酸产量反而降低。当接种量在5～10mL时对L－乳酸产量影响较小，当大于10mL时，随着接种量的增加L－乳酸产量降低，原因可能是接种量太大时，会使发酵液中的营养成分不够菌体生长与发酵，导致菌体死亡率增加，最终使L－乳酸产量降低［14］。

图1 不同发酵时间、接种量、初始pH、中和剂和K2HPO4添加量的L－乳酸产量Fig.1 L－Lactic acid production of different fermentation time，inoculum size，initial pH，neutralization agent and K2HPO4

2.1.3 不同初始pH pH是影响发酵的重要因素之一，控制好pH使其处在适合菌体生长代谢的最佳pH范围［12］。当起始pH低于7.0或高于7.0时，L－乳酸产量都较低，当起始pH控制在7.0时L－乳酸产量最高。这可能是当起始pH较低或较高时都会对菌体的生长代谢产生影响，可能会抑制菌体生长代谢生产L－乳酸［12，16］。由此得出发酵的起始pH 为7时最佳。

2.1.4 不同中和剂 由于乳酸发酵过程中产生了大量的酸，使得发酵液的pH不断降低，当发酵液的pH降到一定程度时不利于菌体的生长和代谢生产L－乳酸。所以，需在发酵液中加入中和剂，以此来中和发酵过程中产生的乳酸［15］，使乳酸形成乳酸盐溶解于发酵液中，这样能够不断地缓冲发酵液pH的降低，从而有利于发酵液维持在适合菌体生长代谢的pH环境中。当中和剂选择碳酸钙时，L－乳酸的产量最高，而其他中和剂虽然能中和掉发酵液中的乳酸，但是这些中和剂溶解后都具有碱性，都会使溶液的pH大于7.0，而碱性环境不利于菌体的生长，会导致菌体大量死亡，所以其他的中和剂不适合在摇瓶水平上作为中和剂来调节发酵的pH并中和乳酸。

2.1.5 K2HPO4添加量 当K2HPO4添加量为1g／L时，L－乳酸的产量最高，当K2HPO4添加量超过2g／L时，L－乳酸产量不断降低，可能是菌体在培养的过程中，一定范围内添加量的K2HPO4有助于菌体代谢生产乳酸，K2HPO4添加过量时不利于菌体进行乳酸发酵［16－17］。

2.2 鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵产L－乳酸的最佳发酵工艺

由表2可知，正交试验各处理L－乳酸产量。对其进行极差分析，4因素对L－乳酸含量的影响依次为D＞C＞A＞B，即酵母粉＞蛋白胨＞葡萄糖＞乙酸钠，酵母粉对乳酸产量影响最大。培养基组分的最佳组合为A3B2C1D2，即葡萄糖16g，乙酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，酵母粉1.0g。

通过单因素和正交优化试验，确定最佳的L－乳酸发酵培养基为葡萄糖16g／100mL，蛋白胨0.25g／100mL，酵母粉1.0g／100mL，乙酸钠0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，吐温－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL和MnSO4·H2O 0.05g／100mL。发酵时间72h，接种量10%，温度37℃，转速150r／min，装液量为100mL，一次性添加碳酸钙10g。以该培养基为最适L－乳酸发酵培养基进行发酵，L－乳酸产量为120g／L，是优化前的1.85倍，表明确定的培养基组分和各组分添加量较为合适。

2.3 发酵罐上罐试验结果

从图2可知，发酵结束后L－乳酸产量为160.5g／L，产L－乳酸速率为2.23g／（L·h），葡萄糖的总添加量为187g／L，糖转化为L－乳酸的转化率为85.56%。对5L发酵罐放大发酵后的发酵液进行L－乳酸的光学纯度分析发现（图3），L－乳酸出峰时间为7.579min，峰面积为7922 239，D－乳酸的出峰时间为9.714，峰面积为382 704。经计算，L－乳酸的光学纯度为95.39%，比优化前提高5.01%，同时优化后的L－乳酸光学纯度接近于相关文献报道的L－乳酸的光学纯度96%［12］。

表2 鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵产L－乳酸的正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation medium optimization of L.rhamnosus ZQ－55producing L－lactic acid

图2 鼠李糖乳杆菌ZQ－55在5L发酵罐发酵过程中的物质变化Fig.2 Material change of L.rhamnosus ZQ－55in the fermentation process in the 5Ltank

图3 乳酸的光学纯度色谱图Fig.3 Chromatogram of the optical purity of lactic acid

3 结论与讨论

采用单因素和正交试验对野生型鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵培养基和发酵条件进行优化，确定最佳培养基为葡萄糖16g／100mL，蛋白胨0.25g／100mL，酵母粉1.0g／100mL，乙酸钠0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，吐温－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL和MnSO4·H2O 0.05g／100mL。最佳发酵条件为发酵时间72h，接种量10%，温度37℃，转速150r／min，装液量为100mL，一次性添加碳酸钙10g。利用5L发酵罐进行L－乳酸的发酵条件放大试验，发酵结束后L－乳酸产量为160.5g／L，产L－乳酸速率为2.23g／（L·h），葡萄糖的总添加量为187g／L，糖转化为L－乳酸的转化率为85.56%，L－乳酸的光学纯度为95.39%。

试验的突破性在于利用优化后的最佳发酵培养基和最适发酵条件，在摇瓶水平上，L－乳酸产量达到120g／L，是优化前的1.84倍。同时，通过5L发酵罐的放大发酵试验，优化出鼠李糖乳杆菌ZQ－55发酵罐放大发酵生产L－乳酸的最适工艺参数，L－乳酸的光学纯度达95.39%，接近于相关文献［12］报道的L－乳酸的光学纯度96%，该结果具有重要的生产实践指导意义，也说明该菌株具有重要的工业应用价值。

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（责任编辑：孙小岚）

Optimization of L－lactic Acid Fermentation Conditions by Lactobacillus rhamnosus ZQ－55

ZHANG Qiang，BO Hui，XING Jianhua，WANG Gaofeng
（Experimental Center of Medical College，Huanghe University of Science and Technology，Zhengzhou，Henan450063，China）

To improve the L－lactic acid production by the L.rhamnosus ZQ－55，single factor experiments and orthogonal tests were used to optimize the fermentation medium and fermentation conditions of L.rhamnosus ZQ－55.The results showed that the optimum fermentation medium for L.rhamnosus ZQ－55was determined as follows：glucose 16g／100mL，peptone 0.25g／100mL，yeast extract 1.0g／100mL，sodium acetate 0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，Tween－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL、MnSO4·H2O 0.05g／100mL.Optimal fermentation conditions were as follows：inoculum size 10%，rotation speed was 150r／min，the fermentation was performed at 37℃for 72h，the medium volume was 100mL，CaCO3（10g／100mL）was used to control the pH value.Under the optimized conditions in flask fermentation，the L－lactic acid production was improved to 120g／L.Finally，fed－batch lactate fermentation by L.rhamnosus ZQ－55 was tested in 5－L fermenter，after 72hfed－batch fermentation，L.rhamnosus ZQ－55produced up to 160.5g／L L－lactic acid，with the yield of 85.56%（g L－lactic acid／g glucose），the productivity of 2.23g／（L·h），the optical purity of L－lactic acid was improved to 95.39%.

Lactobacillus rhamnosus；fermentation；L－lactic acid；optimization

Q939.99

A

1001－3601（2016）08－0355－0122－05

2016－01－09；2016－07－05修回

张 强（1980－），男，实验师，硕士，从事微生物制药工作。E－mail：2977331501＠qq.com