响应曲面法优化叶子花红色素提取工艺

莫大美，吴荣书，彭 毅

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）

加工贮藏·农产品质量

响应曲面法优化叶子花红色素提取工艺

莫大美，吴荣书＊，彭 毅

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）

为保障食品质量安全，获得较多的天然植物色素应用于食品加工中，以紫红叶子花为试验材料，利用乙醇为提取剂提取叶子花红色素，探讨提取时间、提取温度、料液比和乙醇浓度对叶子花红色素提取的影响。在单因素试验基础上，以提取时间、提取温度、料液比和乙醇浓度进行4因素3水平的响应面试验设计，建立叶子花红色素提取量与各影响因子的回归方程，并得到以叶子花红色素提取量为响应值的响应面图和等高线图。结果表明：叶子花红色素的最佳提取工艺为提取温度21.68℃、提取时间67.68min、料液比1∶73.16（g∶mL）、乙醇浓度42.64%，此条件下叶子花红色素提取量为0.160 3mg／mL，与Design－Expert.V8.0.6分析预测最大提取浓度（0.161 53mg／mL）相差较小。

叶子花；红色素；响应面法；提取工艺

叶子花（Bougainvillea spectabilis）俗称九重葛、三叶梅和南美紫茉莉等［1］。叶子花是紫茉莉科中一种常绿攀援状灌木，原产于南美洲热带、亚热带地区，20世纪50年代我国大量引种栽培［2］。据1997年《中药大辞典》记载，其味苦涩、性温，具有调和气血，治妇女赤白带下，月经不调等功效［3－4］。叶子花终年开花不断，形成一树多花色现象，观赏价值高。色素是一种食品添加剂，包括天然色素与合成色素两类，合成色素是人工化学合成，其色泽鲜艳、着色力强、性质稳定且价格便宜，因多属于苯胺类化合物，有致癌和诱导染色体变异的作用，对人体健康造成严重威胁，致其使用受到严格的限制。天然色素安全性高、种类多、无毒副作用，并具有生物活性和药理功能，如今已成为食品添加剂发展的大趋势［5］，而叶子花呈紫色或紫红色含大量天然、健康色素，广泛用于食品、化妆品行业，在食品中不仅有着色作用，而且对保证食品的质量和安全具有重要意义。响应面法包含试验设计、建模、数据分析及条件优化，不仅能对试验建立的数学模型进行分析，反应出各因素对试验结果的交互影响。目前，对叶子花的研究主要集中在提取和稳定性方面，而提取方法单一、传统，只考察单因素对结果的影响，没有反应出各因素对试验结果的交互影响［6］。为此，笔者在溶剂法提取叶子花红色素的基础上［7－9］，采用响应面法优化叶子花红色素提取工艺条件，以期为叶子花的综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

试验材料：紫红叶子花（采自云南农业大学校本部）。

仪器：紫外分光光度计A360（上海柏欣仪器设备厂），RE－52A旋转蒸发仪、小型粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司），真空冷冻干燥机（宁波市双嘉仪器有限公司），电热恒温水浴锅HH－Z（北京市永光明医疗仪器有限公司），震荡仪（上海左乐仪器有限公司）。

1.2 最大吸收波长的确定

称取0.100 0g处理好的碎叶子花苞片，以50%乙醇为提取剂，在室温、料液比1∶40（g∶mL，下同）下浸提1h，再过滤，定容至100mL，在400～650nm波长扫描光谱得到最大可见吸收波长及吸光度，重复3次取平均值。

1.3 标准曲线的绘制

准确称取叶子花红色素1.0mg，用无水乙醇溶解，定容至100mL，配成质量浓度为0.01mg／mL的标准液。分别精确量取标准溶液1mL、3mL、5mL、7mL和9mL加入10mL具塞试管中，以蒸馏水做空白参比，在547nm波长下测吸光度，以吸光度A547为纵坐标，以叶子花红色素浓度为横坐标绘制标准曲线，曲线公式为y＝6.87x－0.103，R2＝0.999 8。

1.4 单因素试验考察

考察不同提取溶剂、提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度及溶剂pH对叶子花红色素提取情况的影响。称取1g处理好的碎叶子花新鲜苞片，在各考察因素下浸提，过滤，以相应提取剂定容至100mL，测定吸光值，平行测样，取平均值，选择最优提取条件。

1.4.1 提取溶剂 在料液比1∶40，常温，pH6.7（以蒸馏水pH为准，下同）条件下以无水乙醇、50%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、三氯甲烷、蒸馏水、丙二酮和氯仿为溶剂浸提1h，测定吸光度（下同）。

1.4.2 提取温度 在50%乙醇料液比1∶40，pH 6.7，温度分别为4℃（冰箱冷藏）、18℃（室温）、30℃、50℃、65℃和75℃条件下浸提1h。

1.4.3 提取时间 在50%乙醇，料液比1∶40，pH 6.7及室温条件下分别浸提20min、40min、60min、80min、100min和120min。

1.4.4 料液比 在50%乙醇，pH 6.7，室温，料液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80条件下浸提60min。

1.4.5 乙醇浓度 在料液比1∶40，室温，pH6.7，乙醇浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%条件下浸提1h。

1.4.6 提取溶剂pH在乙醇浓度40%，料液比1∶40，室温，pH分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10（用NaOH和HCl调整浸提液pH）的条件下浸提1h。

1.5 Box－Behnken试验设计

在单因素试验基础上，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、乙醇浓度（D）为变量，以叶子花红色素提取液的浓度为响应值，确定最佳提取工艺条件，利用响应曲面法中Box－Behnken设计4因素3水平共27组试验，试验因素水平见表1。

表1 叶子花红色素提取的响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of the response surface experiment for extracting red pigment fromB.spectabilis

1.6 回归方程的建立

利用Design Expert软件对响应面试验中的响应值进行二元回归拟合分析与方差分析，建立回归方程。

1.7 响应面分析

根据回归方程绘出等高线图、3D响应面图，从响应面图观察各独立变量之间的交互作用对响应值的影响，分析提取温度、提取时间、乙醇浓度及料液比4个因素对叶子花红色素提取的交互作用。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长

由图1可知，叶子花红色素在波长400～650nm，有2个吸收波峰，可能原因为叶子花色素对可见光红光和绿光都存在吸收峰，其中最大吸收波峰波长547nm为绿光最大吸收峰。

2.2 不同因素提取叶子花红色素的效果

2.2.1 提取溶剂 由表2可知，选用的9种溶剂中，50%的乙醇吸光度最大，蒸馏水次之。三氯甲烷和石油醚提取后基本无色，说明叶子花红色素为水溶性色素，溶于极性溶剂。乙醇浓度为50%时，色素溶解量极少，这进一步说明叶子花红色素溶解于强极性的溶剂。因此，试验选用乙醇为提取溶剂。

表2 不同提取溶剂的叶子花红色素吸光度及提取液颜色Table 2 Absorbance and color of red pigment extracted fromB.spectabilis with different extraction solvent

图2 不同因素提取叶子花红色素的浓度Fig.2 Red pigment concentration extracted fromB.spectabilis with different factors

2.2.2 提取温度 提取温度在4～21℃（室温）时，叶子花红色素浓度呈上升趋势，说明温度升高，溶剂的渗透力大，对叶子花红色素的溶解率变大。当温度达21℃时，叶子花红色素浓度达最高点。但温度从21℃增加到30℃时，叶子花红色素浓度逐渐降低。可能是随着温度的升高，色素开始破坏分解。且采用乙醇为提取溶剂，温度上升，乙醇更易达到沸点，乙醇易挥发，导致提取的色素降低（图2）。

2.2.3 提取时间 在提取时间为20～60min时，色素提取浓度随时间延长明显增加，在60min时达最大，为0.167 3mg／mL；随时间延长，色素浓度明显下降，原因可能是时间延长，溶液中色素浓度达到平衡或邻近平衡，色素扩散速度减慢，而杂质溶解反而加快，致提取量降低（图2）。故提取时间以60min左右为宜。

2.2.4 料液比 随料液比的增加，提取剂用量的加大，叶子花提取液中的色素浓度逐渐增加，色素浸出率相应提高，料液比为1∶70时，色素浓度达最大，为0.138 1mg／mL；当溶剂量继续加大，色素浓度下降，说明色素浸出达到饱和，而溶剂的加入稀释了溶液浓度（图2）。故料液比以1∶70左右为宜。2.2.5乙醇浓度 提取液浓度随乙醇浓度升高而增大，乙醇浓度为40%时，提取效果最好，当乙醇浓度继续增大，提取液浓度明显降低。可能是乙醇浓度加大，溶液极性变小，色素溶解量下降，致浓度下降。故乙醇浓度以40%左右为宜。

2.2.6 pH色素浓度在酸性条件下逐渐加大，色泽呈紫红色，说明酸对叶子花红色素有增色作用。而随着pH的升高，色素浓度呈下降趋势。说明，pH越高，花色苷降解速度越快，色素在碱性介质中不稳定。所以浸提溶液为酸性能取得较好的提取效果。当pH为4时，提取液浓度最高。

2.3 叶子花红色素提取条件的优化

2.3.1 回归方程的建立与检验 由表3可知响应面试验提取叶子花红色素各处理的提取液浓度。通过分析，预测模型为y＝0.16＋2.833×10－3A＋7.0×103B－8.333×10－5C＋4.750×10－3D＋2.750×10－3AB－5.000×10－4AC＋2.500×10－4AD＋6.250×10－3BC＋3.000×10－3BD＋1.500× 10－3CD－0.011A2－0.013B2－4.167×10－3C2－0.012D2

对此回归模型进行方差分析可知，试验所选模型F值为10.05，P＜0.000 1，说明该模型极显著，具有统计学意义；该回归模型的决定系数R2＝0.9214，表明模型具有较高的可信度；叶子花红色素提取浓度的失拟项P＝0.709 6＞0.05，表明失拟项不显著，可见，该模型能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可利用该回归方程确定最佳提取工艺；该回归模型的校正系数Radj＝0.829 8，表明在叶子花红色素提取浓度总的变异中，有82.98%是由独立变量引起；模型拟合程度良好，预测值与试验值之间有较好的的相关性，试验误差小，说明应用响应曲面法优化叶子花红色素的提取模型条件是可行的。

表3 叶子花红色素提取的响应面试验结果Table 3 Response surface test results for extracting red pigment fromB.spectabilis

此外，通过对建立模型进行方差分析，因素A、B、C、D的P值分别为0.045 1、0.000 1、0.948 7和0.002 8，B因素极显著，A和D因素显著，因此，A、B、C和D 4个因素对叶子花红色素提取的影响具有统计学意义，但影响的大小不同，依次为提取时间＞提取温度＞乙醇浓度＞料液比。

2.3.2 响应曲面交互作用 由图3可知，三维响应面曲线图较平缓，说明条件增加对叶子花红色素的提取浓度影响效果不明显；三维响应面曲线图呈上坡状，说明随着条件变化对叶子花红色素提取浓度影响效果明显。在交互项对提取浓度的影响中，等高线图呈椭圆形两因素交互作用明显，等高线图呈圆形，两因素交互作用不明显，即提取温度与提取时间，提取温度和料液比，提取温度和乙醇浓度，提取时间和乙醇浓度，料液比和乙醇浓度及提取时间和料液比之间交互作用明显，与方差分析结果相一致。

2.3.3 最佳提取工艺的确定 通过Design－Expert.V 8.0对叶子花红色素提取模型求最大值得到最佳提取工艺条件和叶子花红色素理论最大提取浓度，其中最佳提取温度21.68℃、提取时间67.68min、料液比1∶73.16、乙醇浓度42.64%，在该条件下，理论最大提取浓度为0.161 53mg／mL。为验证叶子花红色素提取模型方程的适用性，根据最佳提取工艺条件结合实际，对叶子花红色素最大提取浓度理论值进行验证性试验在提取温度21.5℃、提取时间67.5min、料液比1∶73、乙醇浓度42.5%条件下重复试验5次，得到实际提取液浓度为0.160 3mg／mL。从实测值看出，接近理论提取率0.161 53mg／mL，说明响应面法建立的叶子花红色素提取数学模型对叶子花红色素提取稳定可靠。

图3 叶子花红色素提取因素间的等高线图（左）和响应面图（右）Fig.3 The contour map（left）and response surface figure（right）of various factors

3 结论

试验通过对叶子花红色素提取溶剂的优选，确定用50%乙醇提取出的叶子花红色素的最大可见吸收波长为547nm。并运用响应面法优化溶剂提取叶子花红色素工艺，经试验优化后提取叶子花红色素的最佳工艺条件为提取温度21.9℃，提取时间67.69min，料液比1∶73.17，乙醇浓度42.64%，在此条件下叶子花提取浓度为0.160 3mg／mL，理论最大提取率为0.161 53mg／mL，与Design－Expert.V8.0分析预测值相差较小，说明响应面法建立的叶子花提取数学模型稳定可靠，对实际生产应用具有指导意义。

［1］邵志芳，杨义标，邱少松，等.叶子花花期调控技术研究进展［J］.中国农学通报，2005，22（5）：326－328.

［2］叶顶英，张 健.三角梅组织培养外植体再生体系建立研究［J］.四川农业大学学报，2004，22（2）：142－145.

［3］吴淑梅.三角梅的养护技术及应用初探［J］.厦门科技，2002（4）：60－62.

［4］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海人民出版社，1977.

［5］姚成立，毕健洪.天然色素的提取和研究进展［J］.安徽化工，2007，33（3）：1－2.

［6］陈仕学，郁建平，杨 俊.响应面法优化微波提取阳荷水溶性膳食纤维工艺［J］.食品科学，2015，35（18）：57－62.

［7］刘建新，胡浩斌，赵国林.叶子花红色素的提取及其稳定性研究［J］.食品科学，2006，27（8）：98－101.

［8］江丽芳.叶子花色素的提取及稳定性研究［J］.松辽学刊：自然科学版，2002，8（3）：31－34.

［9］陈 林，包季全，蒋 晟.叶子花色素的提取及性质研究［J］.云南民族学院学报：自然科学版，1997，6（1）：40－42.

（责任编辑：孙小岚）

Extraction Process Optimization of Bougainvillea spectabilis Red Pigment by Response Surface Methodology

MO Damei，WU Rongshu＊，PENG Yi
（College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Yunnan，Kunming 650201，China）

To guard the safety of food quality，and gain more natural plant pigment and thus apply in food processing，taking purple B.spectabilis as experimental material，from which red pigment was extracted with ethanol，the effects of extraction time，extraction temperature，solid－liquid ratio and ethanol concentration on red pigment extraction from B.spectabilis were studied.On the basis of single factor experiment，a response surface experiment was conducted with four factors，including extraction time，extraction temperature，solid－liquid ratio and ethanol concentration at three levels.Then the regression equation of red pigment was established with various influencing factors，and the response surface map and contour map were obtained with red pigment extraction as the response value.Results：The optimum extraction process included extraction temperature 21.68℃，extraction time 67.68min，solid－liquid ratio 1∶73.16（g∶mL）and ethanol concentration 42.64%.Under these conditions the extraction amount of reg pigment reached 0.160 3mg／mL，which was close to the predicted maximum extraction concentration（0.161 53mg／mL）analyzed by Design－Expert.V8.0.6.

Bougainvillea spectabilis；red pigment；response surface methodology；extraction process

S38；TS201.1

A

1001－3601（2016）07－0311－0108－05

2015－11－09；2016－06－21修回

莫大美（1988－），女，在读硕士，研究方向：农产品深加工。E－mail：18313854180＠163.com

＊通讯作者：吴荣书（1960－），女，教授，从事园艺产品深加工研究。E－mail：283256929＠qq.com