蚕蛹虫草人工培养的关键技术

张 杨，肖小君，张明月，熊 芹，黄作喜

（内江师范学院生命科学学院，四川内江641199）

蚕蛹虫草人工培养的关键技术

张 杨，肖小君，张明月，熊 芹，黄作喜＊

（内江师范学院生命科学学院，四川内江641199）

为蚕蛹虫草的规模化生产提供技术支撑，以野生北冬虫夏草菌种为接种材料，以家养的活体桑蚕蛹为寄主，研究了蚕蛹虫草菌种制备、接种、发菌至出草的人工培养条件。结果表明：接种前削去蚕茧后放置2d，可有效去除病蛹及生命体征弱的蚕蛹，能在源头上控制污染；接种的蚕蛹虫草液体菌丝的活度越高，接种后的蚕蛹僵化越快；接种部位选择蚕蛹翼翅正后方与第3环节交叉点，易操作且蚕蛹体液和菌液不易溢出；菌丝完成营养生长后，给予300lx光照和10℃温差刺激（300lx光照22℃培养14h，黑暗13℃培养10h为周期）培养7～10d能有效促进蚕蛹虫草菌丝转色和子座的形成，在此条件下出草率达98.5%，虫草平均鲜重达1.25g。

蚕蛹虫草；人工培养；出草率；鲜重

蛹虫草为子囊菌亚门、麦角菌目、麦角菌科、虫草属的模式种，其真菌学名为Cordyceps militaris，又名北冬虫夏草、北虫草等，世界性分布，天然资源数量很少［1］。中医认为，蛹虫草的虫草酸（D－甘露糖醇）入肺肾二经，能滋肺阴、补肾阳，主治肾虚、阳痿遗精、腰膝酸痛、病后虚弱、久咳虚弱、劳咳痰血、自汗盗汗等症，是一种能同时平衡调节阴阳的中药。用活体蚕蛹接种生产蛹虫草［2］，可连同蚕蛹采收、食用，营养价值高，味道鲜美，属于高档滋补品，在欧美及亚洲的韩国、日本等地倍受人们喜爱［3］，其经济价值是销售蚕茧的20～30倍，蚕蛹虫草规模化生产已成为蚕桑业增产创收的新途径［4－5］。为蚕蛹虫草的规模化生产提供技术支撑，笔者进行了蚕蛹预处理消毒、接种部位筛选和光温刺激等影响蚕蛹僵化率和出草率试验。

1 材料与方法

1.1 菌株

供试菌株为野生北冬虫夏草菌种，从广东微生物实验研究所采购。蚕蛹由内江市东兴区桑蚕养殖户提供。

1.2 液体培养基的制备

准确称量马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.0g、柠檬酸铵2.0g、VB150mg和蛋白胨10g［6－7］。将马铃薯去皮后切块，加纯净水1 000mL煮汁20min，用3～4层纱布过滤，滤液中加入上述试剂搅拌溶化，用纯净水定容至1 000mL，用250mL锥形瓶分装后密封灭菌，静置备用［8］。

1.3 培养接种菌液

在超净工作台上将试管菌株内的菌种用接种钩钩出，用解剖刀将其切成米粒大小菌块，接4～5块于液体培养基中，25℃静置24h后置于摇床内，在22℃条件下120r／min摇菌［9－11］3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d和12d。所得菌液用2层无菌纱布过滤，滤液备用。

1.4 蚕蛹的优选、清洗和消毒

一般选择化蛹2～4d的蚕蛹，接种前蛹体表面用棉花蘸取少许75%酒精迅速擦洗消毒，再用无菌水洗去残留酒精［12］。从顶部破开蚕茧后分别放置0d、1d、2d、3d和4d，每组300头蚕蛹，观察期间彻底剔除病蛹、弱蛹，然后进行接种试验。

1.5 接种

在超净工作台上采用注射法接种，用1mL注射器给每只蚕蛹注射0.1mL左右菌液，以菌液不溢出为宜，以免体表滋生杂菌、引起交叉感染。注射部位选取头部、背部第3环节处、腹部第3环节处、尾部、翼翅正后方与第3环节交叉点（图1）。翼翅正后方与第3环节交叉点接种时注射器针头插入蛹体表层1mm左右，然后让针头与蛹体平行，向前推进3mm左右，注入菌液，迅速抽出针头即可，其余接种部位仅需直接插入蛹体表层1mm左右，注入菌液即可。蚕蛹接种后放在玻璃培养皿中，每盘150只，每处理2盘。

图1 蚕蛹虫草接种部位Fig.1 Inoculation position of C.militaris

1.6 培养

将接种的蚕蛹放入培养箱，前期不加盖，地面不补湿，空气湿度保持在60%～65%，22℃黑暗密闭培养，培养3～5d后蛹体开始出现僵化现象，及时剔除未被蚕蛹虫草菌感染和未僵化的蚕蛹；7～10d后气门处可见白色菌丝，菌丝完成营养生长后立即给予光照和温差刺激，用荧光灯均匀光照（300lx），22℃条件下培养14h，黑暗条件下13℃培养10h，以此为周期培养7～10d，以促进菌丝转色和原基的形成，地面全程补湿，空气湿度保持在85%～90%，全程通微风。子座完全形成后进入出草阶段，此时全天进行300lx光照（散射光照应置于蚕蛹虫草的正上方，避免蚕蛹虫草由于趋光性弯曲生长，以保证虫草有良好的品质），温度22℃，地面全程补湿，空气湿度保持在90%，全程通微风［13］。在光照和温差刺激菌丝转色和蚕蛹虫草子座形成的过程中，采用200lx、300lx、400lx光照和5℃、7℃、10℃、12℃温差的培养条件进行交互试验。

1.7 数据统计

统计僵化率、出草率、子实体平均枚数和虫草平均鲜重。僵化率是指蚕蛹接种3～5d后僵化的蚕蛹与接种蚕蛹总数的比值；出草率是指僵化后长出子实体的蚕蛹与僵化蚕蛹总数的比值；子实体平均枚数为蛹体上长出的子实体总数与出草蚕蛹总数的比值；虫草平均鲜重是指蚕蛹虫草的总鲜重与出草蚕蛹总数的比值。

2 结果与分析

2.1 破茧不同放置时间的接种效果

从表1可知，破茧不同放置时间对优选蚕蛹及接种后的僵化率、出草率有明显影响。破茧后蚕蛹当天接种，由于病蛹、弱蛹剔除未尽，其僵化率、出草率分别为79.7%和93.3%。破茧后放置2d，可剔除破茧当天不易发现的病蛹及生命体征弱的蚕蛹，还可保证蚕蛹的生命体征处于良好状态，降低污染率，从源头上有效地抑制污染以及交叉感染（病蛹、弱蛹不能及时僵化而产生霉菌，霉菌四处扩散造成交叉污染），其僵化率、出草率分别达99.3%和99.2%。破茧后放置4d，虽然可以完全剔除陆续出现的病蛹及弱蛹，但此时蚕蛹的生命体征很弱，未等到虫草菌种在其体内建立起种群优势即死去，蚕蛹会腐烂发臭［14］，其僵化率、出草率分别为72.7%和79.6%，在相对封闭的培养箱中，对后续出草生长也有严重的负面影响。

表1 破茧不同放置时间的接种效果Table 1 Inoculation effect of silkworm cocoons after different cocoon－break preparation days

2.2 不同摇菌培养时间接种液体菌种的效果

用摇菌培养3d的液体菌种注射接种，其僵化天数较长，且僵化率较低，出草后的子实体品质低（图2－1），可能因为菌种摇菌培养时间过短，菌液中菌丝球少、浓度低，接种后蚕蛹体内的菌丝量太少，与原有寄居的微生物不能形成竞争优势。培养8d，菌液中菌丝球量多，浓度较高，菌丝生长迅速，腐败变质的蛹体少，接种后的僵化率、出草率分别达99.2%和98%（图3），子实体长而粗壮（图2－2）。培养10d，菌液中的菌丝球浓度更高，但由于培养时间较长，菌液中营养物质逐渐消耗殆尽，菌种也开始老化，生命力降低，将其接入蚕蛹后的侵染力下降，蛹体的僵化时间延长，僵化率和出草率也大幅降低，虫草子实体短小，品质低劣（图2－3）。表明，液体菌种的摇菌培养时间对蚕蛹的僵化率、出草率均有明显影响。

图2 不同摇菌培养时间菌液接种蚕蛹虫草的长势Fig.2 Growth vigor of inoculated C.militaris after different shaking culture days under the liquid culture pattern

图3 不同摇菌培养时间菌液接种蚕蛹虫草的僵化率和出草率Fig.3Rigid rate and germination rate of inoculated C.militaris after different culture days under the shaking culture pattern

2.3 不同接种部位蚕蛹虫草的生长效果

在蚕蛹的头部进行注射接种，蛹体僵化时间最短，但蛹体很快失去生命体征，导致其他菌类对蚕蛹虫草菌的生长产生抑制，出现污染的同时对出草率产生较大影响。在蛹体的背部第3环节处、腹部第3环节处和尾部进行注射接种，蚕蛹体液和注射菌液容易溢出，僵化时间稍长，培养过程中易发霉污染，并导致交叉感染。在蛹体翼翅正后方与第3环节交叉点进行接种，易注射，且蚕蛹体液和注射菌液均不易溢出，可有效避免交叉感染，其接种的效果最好（表2），与柴建萍等［15］的研究结果相似。表明，在翼翅正后方与第3环节交叉点进行注射接种的效果较好。

表2 蚕蛹不同部位接种的虫草生长效果Table 2 Growth effect of inoculated C.militaris on different inoculation position of silkworm cocoons

表3 不同光照及温差培养蚕蛹虫草的生长效果Table 3 Growth effect of inoculated C.militaris under different light intensity and temperature difference

2.4 不同光照及温差刺激下蚕蛹虫草的生长效果

从表3可知，蚕蛹虫草在300lx较强光照和10℃温差刺激后，出草率和子实体品质均较高，与冉翠香等［16］的研究结果相似。待蚕蛹蛹体完全僵化后7～10d，菌丝完成营养生长，在空气湿度60%、光照300lx和温度22℃条件下培养14h，将温度降低至13℃黑暗培养10h，然后循环7～10d，能促进菌丝转色和子座的形成，其出草率和虫草平均鲜重均较高，长势旺盛（图3－1），与李用芳等［17］的研究结果相似。光照弱不利于子座的形成，虫草子实体细短（图3－2），影响虫草的品质和产量；光照过强，子座形成缓慢且形成率低，降低出草率的同时虫草子实体向四周散射生长且倒伏（图3－3），也会影响到虫草的品质和产量［18］。温差过小，刺激不够，子座形成困难；温差过大或低温会导致蚕蛹虫草菌生长停滞［19－20］。

图3 不同光照及温差培养蚕蛹虫草的长势Fig.3 Growth vigor of inoculated Cordyceps militaris under different light intensity and temperature difference

3 结论

1）试验结果表明，蚕蛹破茧后放置2d再接种，有利于剔除后续出现的病蛹、弱蛹，且用于接种蚕蛹的生命体征处于良好状态，可从源头上抑制污染以及大面积交叉感染。液体菌种摇菌培养8d，培养菌液呈混浊状态，微浅褐色，菌丝球量多，浓度较高，菌丝生长迅速，用于接种后蛹体的僵化时间缩短至3d，僵化率、出草率分别达99.2%和98%。

2）蚕蛹虫草为营养滋补性中药，为保证其可食用性，试验过程选择75%酒精涂抹消毒蛹体表面，然后用无菌纯净水冲去酒精，以达到消毒的目的，同时又不会残留任何对人体有毒的物质。接种部位以蛹体的翼翅正后方与第3环节交叉点最好，易注射，且蚕蛹体液和注射菌液均不易溢出，可有效避免交叉感染，其接种效果好。

3）在培养过程中，当蚕蛹虫草菌丝完成营养生长后，立即以光照强度300lx、温度22℃条件培养14h，13℃黑暗条件培养10h为周期培养7～10d，即经光照强度300lx和10℃温差刺激有利于蚕蛹虫草菌丝的转色和子座的形成，在此条件下出草率达98.5%，虫草平均鲜重达1.25g。

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（责任编辑：冯 卫）

Key Technique for Artificial Rearing of Cordyceps militaris

ZHANG Yang，XIAO Xiaojun，ZHANG Mingyue，XIONG Qin，HUANG Zuoxi＊
（School of Life Sciences，Neijiang Normal College，Neijiang，Sichuan641199，China）

The artificial rearing conditions for strain preparation，inoculation，germination and fruiting body of C.militaris were discussed by using living silkworm pupae as hosts and wild C.militaris as an inoculation material to provide the technical support for large－scale production of C.militaris.Results：The broken silkworm cocoons for 2dpreparation before inoculation can efficiently eliminate silk pupae and poor life sign pupae and control contamination at source.The more the hyphal activity of inoculated C.militaris in the liquid medium is，the quicker the rigidity of inoculated silkworm pupae is.The optimum inoculation position is the intersection between the direct view behind wing and third link，which is easy operation and difficult slop over of silkworm cocoon body fluid and fungus fluid.The optimum culture conditions including 300lx light intensity，10℃temperature difference（300lx light intensity at 22℃for 14hand in dark at 13℃for 10h）and 7～10dculture can efficiently promote hyphal coloring and stroma formation of C.militaris after hyphae finish their vegetative growth.The germination rate and average fresh weight of C.militaris under the optimum culture conditions reaches 98.5%and 1.25g separately.

Cordyceps militaris；artificial rearing；germination rate；fresh weight

Q93

A

1001－3601（2016）07－0300－0065－04

2016－03－30；2016－05－31修回

四川省教育厅高校科研创新团队“川西珍稀植物保护与利用”（14TD0025）；内江师范学院2014年度大学生科研资助项目“蚕

蛹虫草关键技术研究”（14NSD－38）

张 杨（1993－），男，在读本科，专业：组培技术及应用。E－mail：542222561＠qq.com

＊通讯作者：黄作喜（1966－），男，教授，硕士，从事植物资源与利用研究。E－mail：huangzx118＠126.com