野罂粟和秃疮花花粉生活力的测定

王林，刘冬云，李佳琦

（1.河北农业大学园林与旅游学院，河北保定071000；2.河北旅游职业学院，河北承德067000）

生理生化·耕作栽培

野罂粟和秃疮花花粉生活力的测定

王林1，刘冬云1，李佳琦2

（1.河北农业大学园林与旅游学院，河北保定071000；2.河北旅游职业学院，河北承德067000）

为野罂粟和秃疮花的杂交育种研究提供参考依据，以野罂粟（Papaver nudicarule）花粉和秃疮花（Dicranostigma leptopodum）花粉为试验材料，采用离体萌发法测定2种花粉的生活力，从而研究不同浓度的蔗糖、硼酸、氯化钙培养液对野罂粟和秃疮花花粉萌发率的影响。结果表明：离体萌发法测定野罂粟花粉生活力的最佳观测时间为5h，最佳培养液组合为蔗糖80g／L＋硼酸40mg／L＋氯化钙40mg／L，该培养组合萌发率为33.7%；离体萌发法测定秃疮花花粉生活力的最佳观测时间为5h，最佳培养液组合为蔗糖70g／L＋硼酸30mg／L＋氯化钙30mg／L，该培养组合萌发率为33.1%。

野罂粟；秃疮花；花粉；生活力；离体萌发法

野罂粟（Papaver nudicarule）和秃疮花（Dicranostigma leptopodum）同属罂粟科。野罂粟属罂粟属多年生草本植物，叶基生，有长柄，花瓣4片，橘黄色，倒卵形，花单生，稍下垂［1］；花期5—7月，花色艳丽，主要观赏其黄色的花朵，有很高的观赏价值，其群体花期较长，作为园林观赏植物具有较大的开发价值［2］；分布于东北、内蒙古、河北、山西、宁夏、新疆和西藏等地，在园林上应用广泛，适宜植于草地、林缘，非常适宜作为观花地被。秃疮花（Dicranostigma leptopodum）属秃疮花属两年生草本植物［3］，高25～80cm；茎多数，绿色，具白粉，上部具多数分枝；基生叶丛生，叶片狭倒披针形；花瓣4，倒卵形或圆形，黄色，子房狭圆柱形；花期3—5月，果期6—7月；花期内观赏价值很高，在园林中具有较大的开发价值。

目前，对野罂粟和秃疮花花粉生活力的研究鲜有报道，魏玉杰等［4］研究表明：红花罂粟花粉萌发的最佳培养基是琼脂20g＋蔗糖110g／L＋硼酸110mg／L＋200mg／L Ca2＋＋80mg／LGA3。笔者采用离体萌发测定法测定对罂粟科的野罂粟和秃疮花花粉的生活力，考察不同浓度蔗糖、硼酸和氯化钙的培养液对野罂粟和秃疮花花粉萌发率的影响，以确定最佳观测时间和最合适的培养液，旨在为野罂粟和秃疮花的杂交育种研究提供参考依据，以期培育出适合在园林上应用的具有观赏价值和抗性强的优良品种。

1 材料与方法

1.1 材料

以种植于河北农业大学西校区野罂粟（Papaver nudicarule）和秃疮花（Dicranostigma leptopodum）花粉为试验材料。试验于2015年4月中下旬在河北农业大学园林与旅游学院基础部301实验室进行。

1.2 花粉的采集、培养

于当日清晨选取生长健壮的植株，并选择即将开放或开放不久的花朵，用镊子轻轻将2种花的花药取出后分别放在铺有硫酸纸的培养皿中。带回实验室散粉，在室温条件下阴干后待用。

培养方法采用悬滴法［5－6］，滴1滴预先配制的培养液于载玻片的凹槽中，将收集的花粉用解剖针散在其上，并混匀，用镊子轻轻盖上盖玻片，然后将载玻片放入带有湿润滤纸的培养皿中，再将培养皿置于25℃恒温光照培养箱中培养，及时向培养皿中补充蒸馏水以保持滤纸湿润，防止液滴蒸发。

1.3 最佳观测时间及最适蔗糖浓度的确定

采用离体萌发法测定野罂粟和秃疮花花粉的萌发率，根据前期预试验配制0、50g／L、100g／L、150g／L和200g／L 5个浓度梯度的蔗糖培养液，向不同浓度的培养液中都添加10mg／L硼酸。每种浓度的培养液3次重复，每隔1h用光学显微镜观测记录，测定不同时间和不同浓度的萌发率。当萌发率不增加时即为最佳观测时间，萌发率较大时的蔗糖浓度区域即为最适蔗糖浓度区域。

1.4 花粉萌发的观测和统计

将培养皿从光照培养箱中取出，取下载玻片置于光学显微镜下观测，先用10倍镜找到花粉区域，再换成40倍镜观察，每个载玻片观测3个视野，每个视野的花粉总数30个以上，记录每个视野的花粉总数和萌发花粉数，计算每个视野的花粉萌发率［7］，取3个视野的平均萌发率作为该载玻片的萌发率。当花粉管长度大于花粉直径时视为已萌发花粉［8］。花粉萌发率的计算公式［9］：

花粉萌发率＝（视野内萌发的花粉数／视野内的花粉总数）×100%

1.5 最佳培养液中单因素的确定

1.5.1蔗糖 根据1.3试验结果确定的最适蔗糖浓度区域，将蔗糖的浓度梯度降低，配制50g／L、60g／L、70g／L、80g／L、90g／L、100g／L、110g／L、120g／L、130g／L、140g／L和150g／L的蔗糖培养液，每种培养液中添加10mg／L硼酸，采用离体培养法对野罂粟和秃疮花花粉进行培养，培养至5h后，观测花粉萌发情况并记录数据以计算萌发率，萌发率最大时浓度即为蔗糖最适浓度。

1.5.2 硼酸 根据1.5.1测定的适宜野罂粟花粉萌发的最适蔗糖培养液浓度和秃疮花花粉萌发的最适蔗糖培养液浓度，并分别加上一定浓度梯度的硼酸配制成蔗糖和硼酸培养液。硼酸选择0、10mg／L、20mg／L、30mg／L、40mg／L和50mg／L 6个浓度梯度，相同的方法进行培养，培养至5h后，分别观测花粉萌发情况并记录数据计算萌发率，萌发率最大时的硼酸浓度即为硼酸的最适浓度。1.5.3氯化钙 根据1.5.2测定的适宜野罂粟萌发的最适蔗糖、硼酸培养液浓度和适宜秃疮花萌发的最适蔗糖、硼酸培养液浓度，分别再加上一定浓度梯度的氯化钙配制成蔗糖、硼酸和氯化钙培养液，氯化钙选择0、10mg／L、20mg／L、30mg／L、40mg／L和50mg／L 6个浓度梯度，相同的方法进行培养，培养至5h后，观测花粉萌发情况并记录数据计算萌发率，萌发率最大时的氯化钙浓度即为氯化钙的最适浓度。

1.6 最适培养液中蔗糖、硼酸、氯化钙的浓度

根据1.5中测定的最适蔗糖、硼酸和氯化钙浓度将蔗糖的浓度梯度进一步降低，野罂粟的蔗糖浓度选择70g／L、75g／L、80g／L、85g／L和90g／L 5个浓度梯度，秃疮花的蔗糖浓度选择60g／L、65g／L、70g／L、75g／L和80g／L 5个浓度梯度，用相同的方法进行培养，培养至5h后，观测花粉萌发情况并记录数据计算萌发率。最终得出最适培养液中蔗糖、硼酸和氯化钙的浓度及萌发率。

1.7 数据处理

数据处理采用微软EXCEL软件［10］和SPSS数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 野罂粟与秃疮花花粉的最佳观测时间及最适蔗糖浓度

由图1可见，野罂粟和秃疮花花粉在25℃恒温光照培养箱中培养1h后未萌发，2h后开始萌发，但萌发率很低且花粉管长度很短，随着培养时间的延长，花粉萌发率逐渐提高，花粉管也逐渐加长，5h后萌发率达最大，7h后的萌发率几乎不再增加，说明5h后花粉的萌发率趋于平稳。在蒸馏水中培养的2种花粉最大萌发率分别为12.6%和10.5%，而在100g／L的蔗糖培养液中培养的花粉最大萌发率分别为20.9%和23.5%，说明野罂粟和秃疮花花粉萌发需要消耗能量。当蔗糖浓度为150g／L和200g／L时花粉萌发率较低，说明蔗糖浓度过高抑制花粉萌发。由此确定，离体萌发法测定野罂粟和秃疮花花粉生活力的最佳观测时间为培养5h后，蔗糖的最适浓度为50～150g／L。

图1 不同培养时间及蔗糖浓度野罂粟与秃疮花的花粉萌发率Fig.1 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith different cultivation time and sucrose concentration

2.2 不同培养液浓度下野罂粟及秃疮花花粉的萌发率

2.2.1 蔗糖浓度 由图2可见，野罂粟蔗糖浓度为80g／L时花粉的萌发率最大，达26.3%，且80g／L处理与其他浓度差异显著；秃疮花的蔗糖浓度为70g／L时萌发率最大，达24.6%，且70g／L处理与80g／L处理无显著差异，与其他处理差异均显著。随着蔗糖浓度的增大，萌发率逐渐降低，说明高浓度的蔗糖抑制花粉萌发。故离体萌发法测定野罂粟和秃疮花花粉生活力的最适蔗糖浓度分别为80g／L和70g／L。

图2 不同蔗糖浓度野罂粟与秃疮花花粉的萌发率Fig.2 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith different sucrose concentration

2.2.2 硼酸浓度 由图3可见，野罂粟在蔗糖浓度为80g／L时，不添加硼酸时的萌发率为26.3%，随着硼酸浓度增大花粉萌发率也逐渐增大，当硼酸的浓度为40mg／L时，花粉的萌发率最大，达27.7%。硼酸浓度为50mg／L时，花粉萌发率降低，为24.3%，硼酸浓度为0时，与其他处理差异显著。秃疮花在蔗糖浓度为70g／L时，硼酸浓度为10mg／L时的萌发率为24.6%，硼酸浓度为30g／L时，与其他处理差异显著。随着硼酸浓度增大花粉萌发率也逐渐增大，当硼酸的浓度为30mg／L时，花粉的萌发率最大，达30.8%。硼酸的浓度为40mg／L和50mg／L时，花粉萌发率降低，分别为28.4%和24.3%。说明，硼酸作为微量元素对花粉萌发和花粉管伸长具有促进作用，但超出一定浓度会产生抑制作用。

图3 不同硼酸浓度野罂粟和秃疮花的花粉萌发率Fig.3 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodum with different boric acid concentration

图4 不同氯化钙浓度野罂粟与秃疮花花粉的萌发率Fig.4 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith different calcium chloride concentration

2.2.3 氯化钙 由图4可知，秃疮花花粉在蔗糖浓度为70g／L，硼酸浓度为30mg／L，不添加氯化钙时萌发率为30.8%。在此培养液的基础上加氯化钙，且设置浓度梯度，当氯化钙浓度为40mg／L时野罂粟花粉萌发率最大，为33.7%；当氯化钙浓度为30mg／L时秃疮花花粉的萌发率最大，为32.6%。不同浓度氯化钙培养液培养的花粉萌发率差异显著。说明，氯化钙能促进野罂粟和秃疮花花粉萌发，但当氯化钙浓度再升高时萌发率下降，说明氯化钙浓度过高反而抑制其花粉的萌发。

2.3 最适培养液下野罂粟和秃疮花花粉的萌发率

由图5可知，当野罂粟培养液硼酸和氯化钙浓度分别为40mg／L和40mg／L时，随着蔗糖浓度的变化，花粉的萌发率呈单峰变化趋势，蔗糖浓度为80g／L时的萌发率最大。当硼酸、氯化钙浓度一定时，野罂粟花粉在不同浓度蔗糖培养液下的萌发率的差异显著。故离体萌发法测定野罂粟花粉生活力的最适培养液为蔗糖80g／L＋硼酸40mg／L＋氯化钙40mg／L，其花粉萌发率为33.7%。秃疮花培养液硼酸和氯化钙浓度分别为30mg／L、30mg／L时，随着蔗糖浓度的变化，花粉的萌发率呈单峰变化趋势，蔗糖浓度为70g／L时的萌发率最大。当硼酸、氯化钙浓度一定时，秃疮花花粉在不同浓度蔗糖培养液下萌发率差异显著。因此，离体萌发法测定秃疮花花粉生活力的最适培养液为蔗糖70g／L＋硼酸30mg／L＋氯化钙30mg／L，其花粉萌发率为33.1%。

图5 最适培养液野罂粟与秃疮花花粉的萌发率Fig.5 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith the optimum culture solution

3 结论与讨论

本试验研究证明，离体萌发法测定野罂粟花粉生活力的最佳观测时间为5h，最佳培养液浓度为蔗糖80g／L＋硼酸40mg／L＋氯化钙40mg／L，其花粉萌发率为33.7%。离体萌发法测定秃疮花花粉生活力的最佳观测时间为5h，最佳培养液浓度为蔗糖70g／L＋硼酸30mg／L＋氯化钙30mg／L，其花粉萌发率为33.1%。

本试验结果显示，在不同培养条件下，野罂粟与秃疮花花粉的萌发率差异显著。关于花粉离体培养的最佳时间，不同植物品种的差异较大，有的培养24h即可观察，有的则培养0.5h即可观察统计［11］。本试验结果表明，野罂粟和秃疮花花粉在培养5h后，花粉管的长度一般为花粉粒直径的4～7倍，此时比较容易统计数目。如果培养的时间过长，虽然花粉的萌发率仍呈上升趋势，但此时花粉管太长，相互缠绕在一起，给统计数目带来一定困难，并且易导致统计结果不准确。而且，在最初这5h中萌发的花粉证明生活力很强，极可能是杂交育种过程中真正起作用的花粉。因此，在进行花粉萌发率的观察时，培养5h后进行镜检统计最合适。

蔗糖一方面为花粉萌发和花粉管的生长提供营养，另一方面起着维持花粉与培养液之间渗透平衡、避免花粉及花粉管的破裂作用。本试验结果表明，不同浓度蔗糖对野罂粟和秃疮花花粉萌发率的影响差异显著。野罂粟花粉的萌发率随蔗糖浓度增大而升高，当蔗糖浓度为80g／L时，花粉萌发率最高，蔗糖浓度＞80g／L时，萌发率随着蔗糖的浓度增大而下降。供试秃疮花花粉的萌发率随蔗糖浓度增大而升高，当蔗糖浓度为70g／L时，花粉萌发率最高，蔗糖浓度＞70g／L时，萌发率随着蔗糖的浓度增大而下降。这可能因蔗糖能维持花粉与培养液之间的渗透压，蔗糖浓度太低，花粉的细胞壁会破裂；浓度过高，造成质壁分离，抑制花粉的萌发生长［12］。

硼在植物体内含量很低，并且分布不均匀，以花中含量最高，且又以柱头和子房最多。硼酸在一定程度上能促进花粉的萌发和花粉管的伸长，在花粉培养过程中虽然需要量少，但却是花粉离体萌发培养液的主要成分，其对糖的吸收和代谢都有促进作用，与糖结合能显著地提高花粉的萌发率，并且增加氧气的含量和吸收，参与果胶物质的合成［12］。本试验结果表明，有硼酸比无硼酸的培养液培养的花粉萌发率高，在一定范围内，随着硼酸浓度的增大，萌发率也随着增大，但当硼酸浓度到一定数值后，花粉的萌发反而受到抑制。因此，最适合野罂粟花粉萌发的培养液中硼酸浓度为40mg／L，最适合秃疮花花粉萌发的培养液中硼酸浓度为30mg／L。

钙离子是影响花粉萌发的很重要的一个因子［13］。高浓度的钙离子对花粉管内细胞骨架的生理活动有很大影响，在花粉管顶端形成较厚的管壁，影响花粉管的生长。有研究表明，外源钙离子可通过花粉管上的钙离子通道调节花粉管内的动态影响花粉管的生长［14］，尤其在花粉管的极性、顶端和定向生长过程中，当钙离子过高时，由于牵拉型的钙离子通道受到伤害，致使花粉管生长受到抑制［15］。在本研究中，也得到了相似的结论，适合野罂粟花粉萌发和花粉管生长的氯化钙的最佳浓度为40mg／L，适合秃疮花花粉萌发和花粉管生长的最佳浓度为30mg／L。

目前，对于野罂粟和秃疮花花粉生活力的研究尚处于起步阶段，本试验有针对性的用离体萌发法测定2种花粉的生活力，对杂交育种来说，进行同种植物间的杂交或在野罂粟科植物中进行远缘杂交还有待于进行深入研究。

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（责任编辑：刘忠丽）

Determination on Pollen Viability of Papaver nudicarule and Dicranostigma leptopodum

WANG Lin1，LIU Dongyun1，LI Jiaqi2
（1.College of Landscape and Tourism，Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071000；2.Hebei Tourism Career Academy，Chengde，Hebei 067000，China）

By using the pollen from P.nudicaruleand D.leptopodumas material，the authors determined the pollen viability with the method of in vitro Kgermination，so as to provide references for studying on hybrid breeding of P.nudicarule and D.leptopodum.The authors made a study of the influence of different concentrations of sucrose，boric acid and calcium chloride on pollen germination.Results：The best observation time was 5hour and the optimum germination medium with the method of vitro germination of P.nudicarule pollen was a medium supplemented with sucrose 80g／L＋boric acid 40mg／L＋calcium chloride 40mg／L and the D.leptopodumpollen was a medium supplemented with sucrose 70g／L＋boric acid 30mg／L＋calcium chloride 30mg／L.The pollen germination of P.nudicarule in the optimum germination medium was 33.7%and that of D.leptopodumwas 33.1%.

Papaver nudicarule；Dicranostigma leptopodum；pollen；viability；in vitro germination method

S602.1

A

1001－3601（2016）07－0288－0018－04

2015－12－09；2016－06－30修回

河北省科技厅项目“京津冀地区节约型乡土地被植物资源的搜集与利用”（15227534）

王 林（1979－），男，讲师，从事植物应用研究。E－mail：linwang79525＠sina.com