乌头霜霉病病原菌DNA提取方法初步研究

欧洪，李娜，徐小山，王光志



乌头霜霉病病原菌DNA提取方法初步研究

欧洪，李娜，徐小山，王光志

［摘要］目的：微量提取乌头霜霉病病原菌DNA，为专性寄生菌的DNA提取提供技术参考，为后续分子生物学实验的展开提供理论基础。方法：无菌毛刷刷取乌头霜霉病病原菌，用OMEGA真菌DNA提取试剂盒提取DNA，用真菌通用引物ITS4/5 PCR扩增。结果：此方法提取的乌头霜霉病病原菌DNA浓度均值为122ng/µL，A260/280均值为1.82，PCR扩增产物在500bp有明亮条带。实验成功提取出了乌头霜霉菌病原菌DNA。结论：此方法提取的DNA浓度及A260/280值均能满足后期实验要求，为后续分子实验提供保障。不同组织提取的DNA经PCR扩增比较后，能够初步得出乌头霜霉病病原菌的特异性片段，能为此类专性寄生菌的DNA提取提供基础。

［关键词］乌头；霜霉病；DNA；PCR；微量提取

［作者单位］成 都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

Email:kzwon@163.com

毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.为常用药用植物，其母根川乌，子根附子，均为知名川产道地药材［1］。乌头霜霉病是附子种植区最为重要的病害之一。在附子道地产区四川省江油市的调查过程中，霜霉病的发病率最高能达到20%～30%［2］。同时，霜霉病常和其它几种病害交互作用导致药材大量减产，严重影响了当地附子产业的发展。霜霉菌的孢子能随着空气气流以及雨水传播，传播极为广泛。快速、准确对霜霉菌的鉴定以及其发病机制的研究，揭示病原菌的遗传结构变化和传播的规律，能为乌头霜霉菌群体生物学和流行学的构建奠定基础；对指导乌头抗霜霉育种和抗病基因的合理布局具有重要意义；为乌头霜霉病的病害过程控制以及防治提供科学基础。

随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究人员把分子生物学技术应用到相关的研究中。通过对病原菌的转录组分析以及功能基因组学的研究，可以显著提高我们对病原菌的认识［3-4］。提取DNA是分子生物学研究的基础和前提，目前的DNA提取方法大多采用提取物的纯化体进行提取［5］。

乌头霜霉菌属于专性寄生菌，目前该菌还未能进行离体培养，导致其病原菌的获得和纯化过程较为困难，严重影响了后续病原菌的群体遗传结构变化和毒性演化等相关研究工作的进展。目前，对乌头霜霉菌的研究甚少，对其DNA的提取研究更是几乎没有，只有在其他植株的霜霉菌的文献中提到霜霉菌的DNA提取［6-8］。本实验建立了一种快速提取乌头霜霉菌微量DNA的方法，具有简单、快速、经济有效的原则。该方法用无菌毛刷直接从乌头患霜霉病的叶片上刷取少量菌丝后用真菌试剂盒提取病原菌的DNA，经过质量检测和PCR扩增，该方法提取的DNA满足后续分子生物学实验技术的需要，从而实现了微量乌头霜霉病病原菌菌丝DNA的提取。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病菌来源 乌头霜霉病植株采自于四川省江油市普照村雅安三九优质无公害附子GAP生产基地。同时采取霜霉病叶片和健康叶片作对照。乌头霜霉病病菌经由成都中医药大学中药资源与鉴定教研室依据症状以及病原菌形态特征认定其为霜霉科霜霉属乌头霜霉菌。

1.1.2 试验仪器和试剂 试剂：OMEGA真菌DNA提取试剂盒，β-巯基乙醇，异丙醇，RNA裂解酶，无水乙醇，ddH2O。

仪器：全自动样品快速研磨仪（型号TISSUELYSER-48 SOP），高速冷冻离心机（型号：Allegra X-30R Centrifuge SOP），PCR扩增仪（型号：T100TMThermai Cycler Bio-Rad ），干式恒温器（型号MK2000-2），微波炉（型号M1-211），凝胶电泳，电子天平（型号YP20001），WH-2微型旋涡混合仪，ND2000 核酸蛋白检测仪。

1.2 基因组DNA的制备

选择健康乌头叶片、轻微发病的绿色叶片、发病严重枯黄的乌头叶片分别剪成2×2cm小段装入2mL离心管中并称重编号，用OMEGA真菌DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.Fungal DNA Min Kit）对叶片进行基因组DNA的提取。同时用无菌毛刷从发病严重枯黄的叶背上刷下菌丝霉层到离心管中称重编号，用OMEGA真菌DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取。具体DNA提取步骤参照OMEGA真菌DNA提取试剂盒提取手册上的说明。

1.3 DNA的检测

将提取的DNA用核酸蛋白检测仪进行DNA质量的检测。

1.4 DNA的PCR扩增

选用真菌通用引物ITS4/ ITS5（由上海生工公司合成）对乌头霜霉病病原菌DNA在 PCR 扩增仪器（BIO-RAD）上进行反应。引物序列（5'端-3'端）如下：

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

PCR扩增体系：25μL体系，2×Taq PCR Master Mix 13μL，引物ITS4和引物ITS5各 1μL，DNA模板2μL，双蒸水补至25μL。

PCR扩增程序：预变性温度94℃ 3min；变性温度94℃30s， 复性温度 55℃1min，延伸温度 72℃1min，共30次循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR 扩增产物在1.5%琼脂糖1× TBE 缓冲系统中电泳， 每孔加样5μL， 用凝胶成像系统检测。

2　结果与分析

2.1 DNA的质量检测

四种不同实验材料提出的DNA用核酸蛋白仪检测DNA浓度及其A260/280值，结果如下表1。其中健康乌头叶片的DNA浓度为128～169ng/µL，轻微发病的乌头叶片的DNA浓度为113～180ng/µL，发病严重的乌头叶片的DNA浓度为96～166ng/µL，霜霉病病原菌的DNA浓度为106～147ng/µL。所有组DNA的A260 /A280值均在1.8左右，可以满足后面实验所需的DNA质量要求。为了明确提取出的DNA是乌头叶片的还是霜霉病病原菌的，所以试验中选取了真菌通用引物ITS4/5对提取出的DNA进行PCR扩增。

表1 DNA浓度以及A260/280值

2.2 DNA的PCR扩增

分别对健康乌头叶片、轻微染病病叶、严重染病病叶以及霜霉病病原菌菌丝提取的DNA用真菌通用引物ITS4/5进行PCR扩增，结果如图2。结果表明真菌通用引物ITS4/5均能扩增出明亮的条带，健康乌头叶片和轻微染病叶片DNA在750bp均有一条明亮条带，严重染病的乌头病叶DNA在750bp和500bp位置出现两条条带，霜霉病病原菌DNA在500bp位置出现一条明亮条带。经过对照分析，可以初步确认从乌头霜霉病病叶上用无菌毛刷刷下的病原菌菌丝提出的DNA为霜霉病病原菌的DNA。可见此方法能够提取出乌头霜霉病病原菌的DNA，只是方法需要更进一步的完善。

图1 DNA样品PCR扩增电泳图

3　讨论

乌头霜霉病是乌头的常见病害，具有传播广，危害性强，难以控制等特点，对中药附子的种植影响甚大，严重限制了附子栽培产业的发展。霜霉病病原菌是完全寄生菌（或称单纯寄生菌），在人工合成培养基上难以培养，研究病原菌的群体遗传结构和生理小种变化，需要扩繁大量病原菌，所用周期长，导致对霜霉菌的研究水平受到很大程度的限制。本研究提取不同发病状况的乌头叶片与病原菌菌丝DNA，然后用真菌的通用引物ITS4/5扩增比较，初步确认提取出了乌头霜霉病病原菌的DNA。

本研究采用微量提取的方法提取乌头叶片中霜霉病病原菌的DNA，具有快速方便，所需材料较少，操作简便等优势，能够提取出符合后期实验要求的DNA。在此实验中，健康乌头叶片DNA与严重染病病叶DNA扩增出在750bp的位置条带一致，严重染病病叶DNA与霜霉病病原菌DNA扩增出在500bp的位置条带一致，由此可以初步判定500bp位置的条带为乌头霜霉病病原菌的特异条带。实验中轻微染病病叶DNA扩增出只有在750bp的位置有明显条带，可能是由于轻微患病的叶片上菌丝量太少，提出的菌丝DNA量太小，扩增出的大部分是乌头叶片的DNA。

微量提取乌头霜霉病DNA 的方法具有重大的意义，能为这类专性寄生菌提供分子生物学研究源头上的保证。本研究仅初步证明了乌头霜霉菌的微量提取和PCR的可行性，后期需要再进一步完善该方法，减少PCR过程中的非特异性扩增，扩大研究病原菌群体的基础上，可将此方法逐步推广到其他专性寄生菌的分子生物学研究中， 同时也能为微量提取DNA的技术提供基础。

［参考文献］

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版一部）［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:177.

［2］唐莉，梁丽娟，叶华智，等. 附子常见病害的调查研究［J］. 现代中药研究与实践，2004，18（6）:29.

［3］Velculescu V E，Zhang L，Vogelstein B，et al. Serial analysis of gene expression［J］.Science-AAAS-Weekly Paper Edition，1995，270（5235）:484.

［4］Wang Z，Mark G，Michael S. RNA-Seq:a revolutionary tool for transcriptomics［J］.Nature Reviews Genetics，2009，10:57.

［5］王飞，巩振辉，马维，等.一种适宜PCR检测的番茄DNA微量提取方法［J］.西北农业学报，2006，15（1）:169.

［6］尹玲，张雅丽，卢江.葡萄霜霉菌基因组DNA不同提取方法的比较［J］.中外葡萄与葡萄酒，2010，（3）:4.

［7］张艳菊，张宏宇，秦智伟，等.黄瓜霜霉菌毒性及分子多态性分析［J］.东北农业大学学报，2010，41（2）:25.

［8］乾义柯，张祥林，克衣木，等.甜菜霜霉病菌形态鉴定及28SrDNA序列分析［J］.新疆农业科学，2012，49（2）:249.

（责任编辑：胡慧玲）

Preliminary study on extraction method of Aconitum carmichaeli Debx.downy mildew pathogen bacteria DNA/

OUHong， LI Na， XU Xiao-shan， WANG Guang-zhi//（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137，Sichuan）

［Abstract］Objective: Microscale DNA of downy mildew pathogen from Aconitum carmichaeli Debx. was extracted to provide technical references for extracting DNA from obligate parasites and theoretical evidence for follow-up molecular biological experiments. Method: Pathogen of downy mildew from Aconitum carmichaeli Debx. was taken with aseptic brush. The universal fungal primers ITS4/5 were chosen in PCR reactions after DNA was extracted with OMEGA fungi DNA extraction kit. Result: Extracted by this method， the average DNA concentration of downy mildew pathogen from Aconitum carmichaeli Debx. was 122 ng.µL-1. The mean value of A260/280 was 1.82. There was a bright strip in 500 bp of PCR products which suggested that the experiment extracted DNA successfully. Conclusion: The concentration and A260/280 of DNA extracted by this method can satisfy later test requirements which guarantee the following process of molecular experiment. Specific fragment of downy mildew pathogen from Aconitum carmichaeli Debx. is analyzed by comparing DNA extracted from different organizations after PCR reactions， which offers basis of DNA extraction of this kind of obligate parasites.

［Key words］Aconitum carmichaeli Debx.； downy mildew； DNA； PCR； microscale extraction

［中图分类号］R 282

［文献标识码］A

［文章编号］1674-926X（2016）02-003-03

［基金项目］四 川省教育厅重点项目

［作者简介］欧 洪（1989-），男，硕士研究生在读，中药资源开发 Tel:15928114716 Email:ouhome@163.com

［通讯作者］王 光志（1976-），男，博士，中药资源开发

［收稿日期］2016-06-06