虎杖生长发育过程中有效成分变化规律的研究

余志芳，罗婷婷，欧泉，马云桐



虎杖生长发育过程中有效成分变化规律的研究

余志芳，罗婷婷，欧泉，马云桐

［摘要］目的：研究不同栽培年限虎杖发育过程有效成分含量的变化规律，确定最佳采收时间，为规范化种植虎杖提供理论依据。方法：以采收年限为主因素，采收月份为副因素，采用HPLC法测定虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄苷、大黄素及大黄素甲醚的含量。结果：无论2年生虎杖还是3年生虎杖，虎杖苷和大黄苷含量两次高峰期均出现在幼苗期和果期；白藜芦醇含量在花期和枯萎期时含量最高；大黄素和大黄素甲醚在秋季达到最高。结论：虎杖采收无论2年或3年均可，采挖时期方面，从有效成分考虑，虎杖可在春季采挖，从产量考虑应在秋季采挖。

［关键词］虎杖；栽培年限；采收期；有效成分；HPLC法

［作者单位］成 都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

Tel:18380191389 Email:zhengnlyzf@163.com

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc.的干燥根茎和根，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效，中医临床用于治疗湿热黄疸、淋浊、带下、风湿痹痛、痈肿疮毒、水火烫伤、跌打损伤、肺热咳嗽等症［1］。其主要活性成分为虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（以下称大黄苷）、大黄素、大黄素甲醚［2-5］。白藜芦醇及其苷虎杖苷具有抗肿瘤、降血脂、抑制血小板聚集、调节脂蛋白代谢、保肝、抗氧化、抑菌等多种药理作用［6-8］，而以大黄素、大黄素甲醚为代表的蒽醌类化合物具有抗菌、保肝、泻下、抗癌等功能［9，10］。目前，虎杖苷注射液用于治疗心肌缺血和脑缺血等疾病［11］，大黄素甲醚作为一种新型植物源农药使用［12，13］。近年，人工栽培虎杖已成为虎杖药材的主要来源，但是关于虎杖的采收季节及采收年限缺少研究，采收年限和采收期是影响药材质量的重要因素，明确不同栽培年限（一般栽培2或3年）和采收时间对虎杖药材质量影响，对于虎杖的优质栽培具有重要意义。

截止目前，对虎杖不同年限有效成分差异有所报道，但是其［14］仅对比了一年生植株与多年生植株中白藜芦醇的含量，未通过其他有效成分进行评价，且未有关于不同采收期有效成分含量变化的研究。本文以2、3年生虎杖为研究对象测定不同生育期5种有效成分（虎杖苷、白藜芦醇、大黄苷、大黄素、大黄素甲醚）的含量差异，从而确定其最佳采收期。

1　材料与试剂

1.1 试验材料

实验材料取自四川省巴中市虎杖种植基地，经成都中医药大学马云桐教授鉴定为蓼科虎杖属植物虎杖，样品通过根茎繁殖，株行距为40cm×65cm，由于一年生样品生物量积累只占其总重的39.95%，因此未采集1年生植株，而是以2年生和3年生植株为研究对象，采挖时期分别为：4月2日（幼苗期），5 月22日（全分枝期），6月21日（花前期），7月30日（花期），9月19日（果期），10月26日（倒苗期），11月20日（枯萎期）。将植株采挖后清洗干净并切片后50℃烘干，粉碎过3号筛备用。

1.2 仪器与试剂

电热鼓风干燥机（上海将任试验设备有限公司）；KQ5200E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；高效液相分析系统配双波长检测器和在线脱气系统（日本岛津公司）； 色谱柱Agilent Zorbax XDB-C18（4.6×250mm，5μm）（安捷伦公司）；BT-457型电子天平（深圳市博途电子科技公司）；QUINTIX224-1CN型电子分析天平（北京sartorius天平有限公司）。

大黄素（批号：131009）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（以下称大黄苷，批号：141209）、大黄素甲醚（批号：140820）、白藜芦醇（批号：150122）、虎杖苷（140828）对照品（以上均购自成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均≥98%）；无水乙醇（分析纯，成都科龙化学试剂厂）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国赛默飞世尔有限公司）。

2.3 色谱条件

Agilent Zorbax XDB-C18柱（4.6×250 mm，5μm）；流动相乙腈-0.5%乙酸水；洗脱梯度（以乙腈浓度表示）：0-10 min，15%；10～18 min，15% ～ 25%；18～35 min，25%～35%；35～48 min，35%～70%；48～65 min，70%～78%，流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长290 nm；进样体积10μL。按照此色谱条件分析得到的样品和对照品色谱图见图1。

2　方法与结果

2.1 对照品溶液制备

分别称取虎杖苷4.87 mg 、白藜芦醇0.08 mg、大黄苷0.75 mg 、大黄素0.23 mg 、大黄素甲醚0.38 mg 至10 mL容量瓶，以甲醇为溶剂定容，稀释2倍后配成混合对照品溶液备用。

2.2 样品溶液制备

称取0.2 g药材粉末，加入60%乙醇25 mL，超声（50kHz）提取30 min，过滤后定容至50 mL容量瓶备用，进样前过0.45 μm滤膜。

图1 虎杖样品中5种有效成分的HPLC图谱

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线绘制 取混合对照品溶液分别进样2μL，4μL，6 μL，8μL，12μL，15μL，分别计算各化合物浓度与色谱峰面积之间的回归方程，结果见表1，各成分浓度与峰面积呈良好的线性关系，r值均大于0.999。

表1 虎杖中5种活性成分的回归方程

2.4.2 精密度试验 取虎杖样品，按照“2.2”项下制备供试品，按照“2.3”项下色谱方法连续进样6次，测定虎杖苷、白藜芦醇、大黄苷、大黄素、大黄素甲醚5种成分的峰面积，计算得各化合物峰面积的RSD（n=6）分别为0.1%，0.3%，0.2%，0.4%，2.0%。

2.4.3 重复性考察 称取5份虎杖样品，按照“2.2”项下方法制备样品，按“2.3”项下色谱条件分析得到样品中虎杖苷、白藜芦醇、大黄苷、大黄素、大黄素甲醚的含量分别为23.763、0.441、7.941、0.596、0.507mg/g，RSD （n=5）分别为2.0 %、1.3%、1.3%、1.7%、2.0%。

2.4.4 稳定性考察 取虎杖样品，按照“2.2”项下制备供试品，根据“2.3”项下色谱方法每隔6 h进样，分别计算各化合物色谱峰面积RSD，各化合物RSD（n=6）分别为0.1%、1.1%、1.1 %、1.8%、2.1%，表明各化合物在36 h内稳定性良好。

2.4.5 回收率试验 分别称取虎杖苷10.010mg、白藜芦醇0.312mg、大黄苷3.960mg、大黄素0.390mg、大黄素甲醚0.49mg至100mL容量瓶中，60%乙醇定容，得到混合储备液。取已知含量（含量由“2.4.3”所得）的样品6份，分别加上述储备液10mL，再加60%乙醇15mL，按“2.2”项方法制备供试品，经“2.3”色谱方法分析得到各样品色谱峰面积，根据峰面积与回归方程计算回收率，结果见表2，虎杖苷、白藜芦醇、大黄苷、大黄素、大黄素甲醚回收率分别为96.7 %、95.2 %、98.1 %、98.2 %、101.0 %。

表2 虎杖中5种有效成分加样回收率（n=6）

0.10865　0.065　0.039　0.104　100.7大黄素0.10216　0.061　0.039　0.100　101.5 0.12179　0.073　0.039　0.110　95.3 0.12345　0.074　0.039　0.114　103.9 0.10395　0.062　0.039　0.097　90.0 0.12265　0.073　0.039　0.111　97.6 98.2　4.6大黄素甲醚0.10865　0.055　0.049　0.106　103.6　100.9　3.6 0.10216　0.052　0.049　0.103　105.3 0.12179　0.062　0.049　0.109　95.4 0.12345　0.063　0.049　0.113　103.1 0.10395　0.053　0.049　0.100　96.8 0.12265　0.062　0.049　0.112　101.4

2.5 样品测定

2.5.1 不同生育期5种活性成分含量变化 将不同年限的各生育期样品粉末按照“2.2”项下方法制备供试品，根据“2.3”项下色谱方法分析，得到各样品中所需化学成分的峰面积，根据“2.4.1”项中曲线回归方程，得样品中各化学成分含量，并根据2015版《中国药典》中烘干法测得各样品中含水量，得以干燥品计各样品中5种活性成分的含量见变3，表4。

表3 二年生虎杖不同生育期5种活性成分含量

表4 三年生虎杖不同生育期5种活性成分含量

由表3和表4可知二年生植株和三年生植株虎杖苷含量从幼苗期到花期均呈现下降趋势，花期含量最低，花期到果期含量大幅升高，果期之后趋于平缓。白藜芦醇从幼苗期开始逐渐升高，到花期达到第一次高峰值，花期后开始下降，11月地上部分完全干枯时达到第二次高峰。大黄苷含量的变化趋势与虎杖苷的趋势相近，幼苗期含量较高，之后开始下降，二年生植株至花期降到最低，三年生植株在现蕾期已降到最低；大黄素含量的变化趋势不明显，但是综合2年生植株和3年生植株分析其主要积累发生在花期之后，枯萎期时积累量达到最大。2年生植株和3年生植株大黄素甲醚含量三次高峰期均出现在幼苗期、花期、枯萎期。

虎杖中5种活性成分存在一定转化，因白藜芦醇是虎杖苷的苷元，大黄素是大黄苷的苷元，笔者前期研究发现当虎杖药材干燥缓慢，含水量较高时其转化越多，即虎杖苷和大黄苷的含量下降而白藜芦醇和大黄素的含量会升高，Tianli Tian［15］等人的研究也发现虎杖中虎杖苷和大黄苷在其根霉微生物作用下可转化为白藜芦醇和大黄素，因此不能通过某个单一的成分来判断虎杖有效成分的含量，而应该通过主要活性成分总含量来判断虎杖的质量。虎杖中芪类成分（虎杖苷和白藜芦醇）和蒽醌类成分（大黄苷、大黄素及大黄素甲醚）含量变化趋势图见图2。

图2 不同生长年限虎杖生育期芪类成分和蒽醌类成分含量变化

图2所示，除花期外，2年生虎杖芪类成分比3年生芪类成分含量略高，2年生植株和3年生植株蒽醌类成分含量变化趋势相似。虎杖从幼苗期到花期活性物质总含量表现出下降趋势，果期达到最高，果期到枯萎期趋于平衡，这说明虎杖有效成分的积累不在营养生长阶段，而在生殖生长阶段。这与药典［1］所载常规的“春、秋季采挖”相一致。

2.5.2 不同部位5种活性成分变化 虎杖属于根茎类药材，植物不同部位次生代谢产物积累量不同，笔者将枯萎期采收的2年生及3年生虎杖药材根和根茎中5种活性成分进行对比，以干燥品计不同部位5种活性成分含量结果见表5。

表5 虎杖不同部位5种活性成分含量

表5所示，二年生植株根与根茎中虎杖苷和白藜芦醇差异较小，但是三种蒽醌类成分差异较大，根茎中含量分别达到根中含量的3.3倍、2.1倍和1.6倍。三年生虎杖根与根茎中虎杖苷的含量差异较大，根茎中含量是根中含量的1.4倍，白藜芦醇的含量差异不明显，根茎中三种蒽醌类物质较根中高，分别是根中含量的1.5倍、1.4倍和1.4倍。

3　讨论

从“2.5.1”不同生育期5种活性成分的含量变化可知，2年生和3年生虎杖均在营养生长阶段总活性成分呈降低趋势，花期时出现最小值，之后开始积累到果期呈现最大值，果期之后趋于稳定，从活性成分考虑最佳采收期应选春季，考虑到产量采收期应选秋季，这符合虎杖药材的常规采收时间。若在秋季采挖，以活性成分含量最高的果期为例，从“图2”知2年生植株芪类含量（39.82mg/g）高于3年生植株含量（36.00mg/g），而其蒽醌类含量（11.45mg/g）低于3年生植株含量（12.36mg/g），但是差异均较小，故从活性成分考虑，虎杖药材2年或3年采挖均可。图2所示虎杖药材中芪类成分含量没有因生长年限而升高，原因可能是“表4”所示的虎杖根中活性成分含量低于根茎中的含量，尤其3年生植株与根茎中含量差异较大，而3年生植株根的生物量对总生物量（根及根茎）的百分占有量（38.0%）高于2年生植株根的百分占有量（21.2%），因此虎杖2年或3年采收还受其产量和药材的市场价格影响。

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（责任编辑：胡慧玲）

Research of active components change of Huzhang during the growth process

YU Zhi-fang， LUO Ting-ting， OU Quan，MA Yun-tong//（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137，Sichuan）

［Abstract］Objective: In order to provide a basis for good agriculture practice for Huzhang， the influence of different cultivation years and harvesting period on active components was studied. Method: The cultivation year was used as a main factor，and harvesting period as second factor. The contents of polydatin， resveratrol， emodin-8-O-glucoside， emodin and physcion in Huzhang were determined by HPLC. Result: The highest contents of polydatin and emodin-8-O-glucoside of the biennial and three year-old Huzhang appeared in seeding period and fruit period. The highest contents of resveratrol appeared in blooming period and withered period. The highest contents of emodin and physcion occurred in autumn. Conclusion: Huzhang can be cultivated two or three years. Considering the content of active components， it can be harvested in spring. While considering the productivity， it can be harvested in autumn.

［Key words］Huzhang； cultivation period； harvesting period； active component； HPLC

［中图分类号］R 282.4

［文献标识码］A

［文章编号］1674-926X（2016）02-001-04

［基金项目］巴 州区道地中药材虎杖种植技术集成及产业化示范项目（编号：313-672）

［作者简介］余 志芳（1989-），女，硕士生，从事中药品种、质量及资源研究

［通讯作者］马 云桐（1963-），男，教授，从事中药种质及资源研究工作 Email:mayuntong06@163.com

［收稿日期］2016-03-04