七带石斑鱼神经坏死病毒的RT—LAMP检测方法

刘滨++刘新富++曾霖++孟振++刘江春

摘 要：报道了一种可以快速、灵敏地检测七带石斑鱼神经坏死病毒（NNV）的逆转录环介导等温扩增方法（RT-LAMP）。该方法参考赤点石斑鱼NNV病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因的保守序列，设计1对引物克隆出七带石斑鱼NNV的基因序列，利用Primer Explorer V4 软件设计了3对针对所克隆NNV基因序列的特异性引物，建立了RT-LAMP的反应体系，并分别对反应系统的引物浓度、反应温度和时间进行了优化，形成了七带石斑鱼NNV病毒RT-LAMP检测技术。实践应用结果表明，在63 ℃的最佳反应温度下，采用RT-LAMP检测技术经过45 min就能完成一次检测，准确率达到100 %。本研究建立的RT-LAMP检测NNV技术设备要求简单，为七带石斑鱼等石斑鱼无NNV受精卵和仔稚鱼的生产现场检测和筛选提供了一种方便、灵敏的检测方法。

关键词：七带石斑鱼；神经坏死病毒；检测；RT-LAMP

中图分类号：S941 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.07.006

Abstract：A rapid and sensitive technique for detecting of Nervous Necrosis Virus in seven-band grouper was developedthrough reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP） method. A set of six specific primers were designed based on MCP gene of Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus （ RGNNV） using Primer Explorer V3 software. The parameters of primer concentration， reaction time and temperature were optimized.The RT-LAMP method established in this article was applied to detect nervous necrosis virus of seven-band grouper larvae in the fish farming field， the results showed that the sensitivity of RT-LAMP method was consistent with the nested RT-PCR method， as well as the detection result of RT-LAMP method could be easily determinate，andthe detection time was short， which can be completed within 2 hours. The RT-LAMP assay developed in this article wasvery suitable for rapid diagnosis of early NNV infection of seven-band grouper larvae in fish farming field.

Key words： seven-band grouper （Epinephelus septemfasciatus）； nervous necrosis virus （ NNV）； detection； reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）

七带石斑鱼（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我国沿海分布纬度最高的石斑鱼种类，除了具有个体大、生长速度快和经济价值高等特点外，对低温的耐受能力较强，生存水温9～34 ℃，摄食水温12～32 ℃，有“冷水石斑”之称，被认为是东北亚温带海域网箱养殖理想海水鱼类品种之一[1]，其苗种繁育技术的突破，可以缓解我国东海北部和黄渤海沿岸网箱适养鱼类品种缺乏的问题，因此备受业界重视。但是尽管国内外研究多年，七带石斑鱼的苗种繁育技术始终不能稳定，在所面临的技术瓶颈中，神经坏死病毒（nervous necrosis virus，NNV）造成的早期苗种死亡率居高不下是目前最亟待解决的关键问题。

病毒性神经坏死病（viral nervousnecrosis，VNN）是造成多种海水鱼类早期发育阶段大量死亡的诺达病毒科（Nodaviridae）的一种小RNA病毒[2]，对石斑鱼的危害尤为严重，常常造成90%以上的仔稚鱼死亡。为了明析NNV的传播途径和研发出相应的预防技术，目前国内外研究学者已经开发出了多种NNV检测技术，如原位杂交、免疫组织化学方法、荧光抗体技术、细胞培养、ELISA、逆转录酶链式聚合反应（RT-PCR）和实时定量PCR等方法[3-7]。目前在生产实际中较为有效的检测手段均建立在神经坏死病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的PCR扩增基础之上，但仍然存在操作繁琐、周期长、需要专用仪器设备等缺点，无法满足实际生产中快速、敏感、准确的检测需求。

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸片段扩增技术，该技术由日本学者Notomi等于2000 年首先开发，其核心由4条引物（2条外引物和2条内引物）和一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）组成，原理是通过使链置换DNA的合成不停地自我循环以到达快速高效扩增的目的[8]。LAMP技术在恒温（60～65 ℃）条件下进行核酸扩增，可以通过肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀或加入染料观察颜色变化[9]判定结果。Nagamine K等[10]于2002年通过在4条引物的基础上添加了2条环引物LF/LB，能够明显加快反应速度，提高扩增效率。由于LAMP技术具有反应快速、操作简便、成本低、结果易判定等优点，目前已经被成功用于检测鱼类的诸多致病病毒，如弹状病毒、虹彩病毒、病毒性出血败血症病毒和呼肠孤病毒等[11-15]。

本研究在克隆出七带石斑鱼神经坏死病毒（SGNNV）核酸序列的基础上，建立了基于环介导等温扩增技术的七带石斑鱼神经坏死病毒LAMP检测方法，以期为今后在七带石斑鱼养殖产业中进行现场、即时的高效病毒检测提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 生物材料 2012年于莱州明波水产有限公司采集的8份表现病毒性神经坏死症状的七带石斑鱼苗种和2份健康苗种；所有发病苗种均通过陈信忠等发表的RT-PCR方法检测确定后于-70 ℃保存备用。

1.1.2 病毒RNA 取发病七带石斑鱼的肾、脾、脑等组织混合匀浆，提取病毒RNA参照TRIzol Reagent（Invitrogen）使用方法，从100 mg组织中提取总RNA，-70 ℃保存备用；石斑鱼虹彩病毒（SIGV）序列为笔者根据Genbank中收录的石斑鱼虹彩病毒（ID：AY621625）进行体外合成后于本实验室保存。

1.1.3 试剂与仪器 Bst DNA Polymerase和10×Thermo Pol buffer 购自纽英伦生物技术有限公司；反转录试剂盒购自Fermentas公司；Premix Taq、DL2000 DNA marker、dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自台湾生工；SYBR Green Ⅰ购自厦门百维信公司；甜菜碱（分析纯）购自美国Sigma公司；琼脂糖购自台湾生工；BIO-RAD MyCycler梯度PCR仪，恒温金属浴及冷冻离心机等仪器均为国产。

1.2 方 法

1.2. 七带石斑鱼NNV病毒序列鉴定 根据Genbank已报道的赤点石斑鱼神经性坏死病毒MCP基因序列，进行序列比对后选取最为保守的中间部分设计引物NNV-F和NNV-R，引物序列见表1。以提取的2 μL总RNA为模板、NNV-R为引物，反转录合成cDNA。以2 μLcDNA为模板、NNV-F和NNV-R为引物，使用Premix Taq进行常规PCR扩增，反应体系终体系25 μL。PCR程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，46 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃延伸10 min，反应结束后对PCR产物进行电泳检测。其余PCR产物经试剂盒回收后送博尚生物技术有限公司进行直接测序，测序结果经Blast程序与Genbank中收录的石斑鱼神经坏死病毒MCP基因序列进行比对确认。

1.2.2 LAMP引物设计 采用Primer Explorer V4软件（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）针对七带石斑鱼神经性坏死病毒MCP基因序列设计6条引物，依次为正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向环引物（LF）及反向环引物（LB），由博尚生物技术有限公司合成引物，引物序列见表1。

1.2.3 反应体系建立及优化 建立的RT-LAMP反应体系由2.5 μL10×ThermoPol buffer，1.6 μmol·L-1 FIP、BIP，0.2 μmol·L-1 F3、B3，0.8 μmol·L-1 L F、LB，2 mol·L-1 Betaine、4 μL10 mmol·L-1 dNTP，6 mmol·L-1 MgSO4，0.5 μL 200 U Reverse Transcriptase MMLV（TaKaRa），1 μL 8U Bst DNA聚合酶（New England Biolabs），0.5 μL 40 U Ribonuclease inhibitor（TaKaRa）和2 μL模板组成。为优化反应温度，将经过简短离心混匀后的反应混合物分别在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃反应1 h后，再经过82 ℃10 min终止反应。为测定环引物对反应时间的影响，分别采用4条引物（FIP，BIP，F3，B3）和6条引物（FIP，BIP，F3，B3，LF 和LB）的反应体系，选择63 ℃的反应温度，分别反应25，35，45，55，60，65，75，85，95 min，再经过82 ℃10 min终止反应。随后对不同反应温度和不同反应时间下的扩增产物进行凝胶电泳法及荧光染料法检测。在凝胶电泳检测中，如果出现典型的梯形条带即表明发生了扩增反应；在SYBR GREENⅠ荧光染料法检测中如果反应体系颜色变绿，则说明发生扩增反应；如果反应体系颜色依旧为橙色，则说明未发生扩增反应。

1.2.4 特异性分析 分别取神经坏死病毒和虹彩病毒的核酸样本为模板进行LAMP方法检测，并以水作为模板设置空白对照。分别采用琼脂糖凝胶电泳法及SYBR GreenⅠ法荧光染料法检测反应结果，分析方法的特异性。

1.2.5 现场检测结果 在养殖现场对10尾待检的石斑鱼，开展了NNV病毒的LAMP方法检测，在检测过程中，分别以NNV RNA和水为模板作为阳性对照和空白对照。同时采用PCR方法与LAMP的检测结果进行比较。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应体系的建立

2.1.1 反应温度的优化LAMP 反应在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃均有扩增，并且扩增产物亮度比较接近，说明该反应体系中的引物设计比较理想，反应条件具有比较好的宽容性，能够保证反应体系充分有效扩增。在所有的温度梯度中63 ℃下的产量相对更高，因此，可确定最优的LAMP反应温度为63 ℃，电泳结果及SYBR GreenⅠ检测结果见图1。

2.1.2 反应时间的优化 当反应体系中加入环引物时，LAMP反应45 min就可观察到明显的扩增，而在无环引物时，在反应时间到95 min时仍无明显的扩增产物出现（图2）。表明在反应体系中加入环引物能够显著地缩短反应时间。为了保证低浓度的样本能够充分反应并得到准确地检测，采用了60 min作为本LAMP方法的反应时间。