三七重茬土壤中高效解磷菌的筛选和鉴定

龙赛波， 张晓东，王志远， 赵 静*

(1.玉溪师范学院资源环境学院，云南玉溪 653100；2. 德宏师范高等专科学校，云南芒市 678400)

三七重茬土壤中高效解磷菌的筛选和鉴定

龙赛波1， 张晓东1，王志远2， 赵 静1*

(1.玉溪师范学院资源环境学院，云南玉溪 653100；2. 德宏师范高等专科学校，云南芒市 678400)

摘要[目的]从三七重茬土壤中富集筛选解磷菌。[方法]分别于有机磷平板培养测定解磷圈大小，以Ca3(PO4)2为唯一磷源的无机磷液体培养基中连续培养14 d，测定其溶磷量。[结果]从3株解磷菌中筛选到了1株具有较好解磷效果的菌株P9，菌株P9的菌落直径最小，解磷圈直径最大，接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、葡萄糖产酸、肌醇产酸均为阳性，吲哚试验呈阴性。[结论]生理生化试验和16SrDNA测序表明，P9为欧文氏杆菌(Erwinia tasmaniensis)。

关键词重茬土壤；解磷菌；欧文氏杆菌

土壤磷素循环是以微生物活动为中心，微生物的活动对土壤磷的转化和有效性影响很大。相关研究发现，微生物是控制和影响磷释放的重要因素，可直接参与磷的循环[1]。解磷微生物(PhosphateSolubilizingMicroorganism,PSM)能够将有机磷分解为无机磷，把不溶性磷化合物转化成可溶性磷[2]。目前，解磷微生物绝大多数是从土壤样品中分离得到[3]。Kim等[4]报道了分离自植物根际土壤的1株解磷菌伯雷克氏菌MB14在沉积物除磷中的应用，以防止湖泊或池塘富营养化的发生。重茬土壤中，由于植物对营养元素的偏好，使土壤营养元素呈现生理性不平衡现象，一些元素如Fe、Mn、B、Zn不断减少，造成作物营养平衡失调，出现缺素症状。而随着重茬年限的增加，土壤中氮、磷、钾总量变化却不大，原因可能是土壤中存在一定的解磷微生物。笔者拟从三七重茬土壤中分离高效解磷菌，测定其解磷能力，旨在为解除土壤中磷的富营养化提供科学依据。

1材料与方法

1.1培养基的制备

1.1.1无机磷细菌固体培养基[5]。葡萄糖 10.00g，(NH4)2SO40.50g，NaCl0.50g，KC1 0.30g，MgSO4·7H2O0.30g，Ca3(PO4)210.00g，FeSO4·7H2O0.03g,MnSO4·4H2O0.03g。琼脂粉18～20g/L，蒸馏水1L，pH7.0～7.5。

1.1.2有机磷细菌液体培养基[6]。葡萄糖10.00g， (NH4)2SO40.50g，NaCl0.30g，KCl0.03g，MgSO4·7H2O0.30g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，CaCO35.00g，(NH4)3PO40.50g。加蛋黄液10mL(蛋黄液由无菌生理盐水与鸡蛋1∶1配制)， 蒸馏水1L，pH为7.0～ 7.5。生理盐水(9.00gNaCl溶于1L水中)。

1.2解磷菌的分离与筛选称取5g三七重茬土壤，加入10mL水。取1mL与灭菌蒸馏水按1∶0、1∶1、1∶5的比例在无机磷固体培养基中涂板，于37 ℃培养24h。挑选长势较好的菌落在有机磷培养基中培养，测量菌落和解磷圈的直径。挑选出解磷效果较好的菌株接种于有机磷培养基中[7]。

1.3解磷能力的测定

1.3.1固体平板解磷能力[8]。将筛选的菌株点接于有机磷固体平板中培养，并测量菌落直径和解磷圈直径。

1.3.2液体培养基溶解Ca3(PO4)2能力。取菌株分别接入10mL无机磷液体培养基中，30 ℃下200～250r/min振荡培养3d。取上述所得菌液2mL加入到100mL有机磷液体培养基中，30 ℃下200r/min振荡培养14d。每天取1mL菌液于灭过菌的离心管中，4 ℃保存，待测。采用磷钼蓝比色法[8-9]测定解磷吸光光度值。

1.4菌株的鉴定

1.4.1生理生化试验。参照文献[10]对菌株P9进行生理生化特征试验。

1.4.216SrDNA基因片段序列测定。参照Weisburg等[11]的方法扩增细菌的16SrDNA片段。采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1525R(5′-AAGGAGGTGWTCCARCC-3′)，预期扩增片段大小为1 500bp。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化测序。

2结果与分析

2.1解磷细菌解磷圈直径与菌落直径通过无机磷培养，共分离得到12株解磷菌，采用平板法进行初筛，根据解磷圈直径和菌落直径比值筛选到3株解磷效果较好的菌株(表1)。由表1可知，3个菌株中P9的菌落直径最小，为2.0mm，但其溶磷圈直径最大，达4.0mm。菌株P9相对于P10、P12，生长速度稍慢。从平板显示法的估算难以全面鉴定出各解磷菌的解磷能力，需要通过液体发酵培养测定其溶解Ca3(PO4)2的能力，以进一步分析其解磷能力。

表1解磷细菌解磷圈直径与菌落直径比较

Table1Comparisonofphosphate-solubilizingdiameterandcolonydiameter

菌株Strain菌落直径Colonydiameter(d)∥mm解磷圈直径Phosphate-solubilizingdiameter(D)∥mmD/dP92.04.02.000P105.53.00.545P126.03.00.500

2.2解磷细菌对Ca3(PO4)2的溶解能力从图1可见，随着培养天数的延长，3株待测菌株上清液中水溶性磷含量均呈逐渐增加趋势，其中菌株P9在第11天出现峰值，水溶性磷含量达248mg/L；菌株P10在第11天出现峰值，水溶性磷含量为170mg/L；菌株P12在第12天出现峰值，水溶性磷含量为217mg/L。出现峰值后，3个菌株待测液上清液中水溶性磷含量趋于平衡。

图1　菌株P9、P10、P12的解磷曲线Fig.1　The phosphoate-solubilizing curve of strains P9, P10 and P12

2.3菌株的鉴定结果

2.3.1生理生化鉴定结果。对菌株P9进行生理生化测定，结果表明，接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、葡萄糖产酸、肌醇产酸均为阳性，吲哚试验呈阴性(表2)。

表2菌株P9的生理生化鉴定结果

Table2TheresultsofphysiologicalandbiochemicalidentificationofstrainP9

序号SevialNo.指标Index性质Property1接触酶Catalase+2淀粉水解Hydrolyzingstarch+3硝酸盐还原Nitratereduction+4吲哚Idoltest-5葡萄糖产酸Acidproductionfromglucose+6肌醇产酸Acidproductionfrominositol+737℃生长Growthat37℃+

2.3.216SrDNA基因片段序列测定结果。为进一步确认所分离的菌株种属类型，对P9进行16SrDNA序列测定，测定结果在GenBank数据库中进行Blast比较，并构建系统发育树(图2)。结果表明，菌株P9与欧文氏杆菌(Erwinia tasmaniensis strain)(NR_074869.1)有99%的相似性。结合生理生化鉴定和16SrDNA结果可知，菌株P9属于欧文氏杆菌。

图2　菌株P9的16S rDNA系统发育树Fig.2　16S rDNA phylogenetic tree of strain P9

3结论与讨论

(1)该研究通过无机磷培养初筛，共分离到12株解磷菌。根据解磷圈直径和菌落直径比值筛选到3株解磷效果较好的菌株。其中，菌株P9的菌落直径最小，但溶磷圈直径最大，说明该菌株具有较强的解磷能力。对菌株P9进行生理生化测定，结果表明，接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、葡萄糖产酸、肌醇产酸均为阳性，吲哚试验呈阴性。16SrDNA基因片段序列测定结果说明，菌株P9为欧文氏杆菌。

(2)目前，利用微生物肥料修复及缓解植物连作障碍已成为解决连作障碍的主要手段之一。解磷菌能够提高土壤中有效磷含量，增加土壤肥力，促进植物生长，在一定程度上能缓解作物连作障碍。至于该研究得到的菌株P9是否具有其他促生作用，有待于进一步研究。

参考文献

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IsolationandIdentificationofPhosphate-solubilizingBacteriafromContinuousCroppingSoilofPanax notoginseng

LONGSai-bo1,ZHANGXiao-dong1,WANGZhi-yuan2,ZHAOJing1*

(1.ResourcesandEnvironmentCollege,YuxiNormolUniversity,Yuxi,Yunnan653100; 2.DehongTeacher’College,Mangshi,Yunnan678400)

Abstract[Objective] The aim was to isolate phosphate-solubilizing bacteria from continuous cropping soil of Panax notoginseng. [Method] The size of phosphate-solubilizing cycle was determined on plate using Ca3(PO4)2 as the sole source of inorganic phosphorus liquid in the running 14 days, and whose phosphate-solubilizing capacity was determined. [Result] From three isolated strains, one strain P9 having good phosphate-solubilizing effect was selected. The colony diameter of strain P9 was the smallest, and the diameter of phosphate dissolving circle was the largest. Contact enzyme, starch hydrolysis, nitrate reduction, glucose acid production, inositol acid production were positive, the indole test was negative. [Conclusion] Physiological, biochemical test and 16SrDNA sequencing indicates strain P9 belongs to Erwinia tasmaniensis.

Key wordsContinuous cropping soil; Phosphate-solubilizing bacteria; Erwinia tasmaniensis

基金项目云南省大学生创新项目(2011B15)；云南省教育厅研究基金项目(2013C140)。

作者简介龙赛波(1991- )，女，云南保山人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，讲师，博士，从事植物病害生物防治研究。

收稿日期2016-03-21

中图分类号S 154.3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)12-082-02