以脂肪酶活为指标快速筛选吉他霉素高产菌株的研究

刘守强， 赵 中， 王雪洁， 刘 果， 周淑梅

(1.天方药业有限公司,河南驻马店 463000;2.黄淮学院数学科学系,河南驻马店 463000;3.河南省驻马店市环境保护局,河南驻马店 463000)

以脂肪酶活为指标快速筛选吉他霉素高产菌株的研究

刘守强1， 赵 中2， 王雪洁1， 刘 果1， 周淑梅3

(1.天方药业有限公司,河南驻马店 463000;2.黄淮学院数学科学系,河南驻马店 463000;3.河南省驻马店市环境保护局,河南驻马店 463000)

摘要[目的]筛选吉他霉素高产菌株。[方法]以1株北里链霉菌Zn14-05为出发菌株,进行紫外线与NTG复合诱变处理，通过以脂肪酶活力为初筛指标和摇瓶复筛筛选吉他霉素高产菌株。[结果]摇瓶发酵效价比出发菌株提高10%；传代试验结果表明其遗传性能稳定。[结论]以高脂肪酶活性为初筛指标选育吉他霉素高产突变株，缩短了选育周期，减少了初筛工作量，提高了选育效率。

关键词紫外射线；突变株；吉他霉素；脂肪酶

吉他霉素是由链霉菌所产生的一种多组分的大环内酯类抗生素，抗菌性能与红霉素相似，对革兰阳性菌有较强的抗菌作用，较红霉素稍弱，但对耐红霉素等金黄色葡萄球菌有效，细菌对之耐药性产生较慢，该品系非耐药诱导药物。随着抗生素耐药问题的不断凸显，吉他霉素以其低耐药性的特性，丰富了现有抗生素品种，并且作为一种兽用饲料添加剂，市场需求较大。吉他霉素生产研究进展较缓慢，自1953年发现以来，期间不断有研究报道筛选出优良高产菌株，1990年四川抗菌素工业研究所分离得到1株高产菌株，其效价较原菌株提高100倍，后期研究在提高菌株效价的同时，提高了吉他霉素有效组分的含量，实现了工业化生产，自1995年以来，生产技术一直没有大的突破。

在抗生素发酵过程中，工业化生产菌大多数是通过诱变育种方法获得，传统的诱变育种不仅可以获得稳定的高产菌株，更以技术要求不高和操作简便而在生产中广泛应用。 笔者通过对出发菌株紫外诱变结合氯化锂、NTG复合处理，以高脂肪酶活力为初次筛选指标，进行了吉他霉素高产菌株选育，以期为吉他霉素工业化生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌。吉他霉素菌株Zn14-05由河南天方药业股份有限公提供。

1.1.2培养基。平板培养基：淀粉15.00 g/L，磷酸二氢钾0.50 g/L，硫酸镁0.60 g/L，酵母膏4.00 g/L，豆油40.00 g/L，琼脂21.00 g/L,消前pH 7.2,罗丹明B，氯化锂 8.00 g/L。种子摇瓶培养基：淀粉20.00 g/L，黄豆饼粉18.00 g/L，氯化钠4.00 g/L,葡萄糖10.00 g/L,碳酸钙3.00 g/L,消前pH 7.2。发酵摇瓶培养基：淀粉18.00 g/L，黄豆饼粉20.00 g/L，硫酸锌0.06 g/L，磷酸二氢钾0.50 g/L,豆油40.00 g/L,消前pH 7.2。

1.2方法

1.2.1培养方法。

1.2.1.1平板、斜面培养。(28.0±0.5)℃恒温培养10 d，4 ℃冰箱保藏。

1.2.1.2种子培养。由茄子瓶斜面挖约1 cm2大小块状物，接入装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，(28.0±0.5)℃、240 r/min 摇床培养26～32 h。

1.2.1.3摇瓶发酵培养。 将种子液按10%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，(28.0±0.5)℃、240 r/min 摇床培养110 h。

1.2.2诱变方法。以吉他霉素菌株Zn14-05为出发菌株，用铲子刮下新鲜斜面孢子，放入装有玻璃珠并加入无菌生理盐水的三角瓶中，摇匀搅散，灭菌后单层擦镜纸过滤,镜检单孢子分散度在95%以上用于诱变处理。在诱变前进行稀释，然后按常规诱变方法进行诱变处理[1]。

1.2.3筛选方法。

1.2.3.1紫外线诱变筛选。吸取单孢子悬浮液6 mL于含磁力旋子的平板中, 置于30 W的UV 灯(253.7 nm)下25 cm处,通过磁力搅拌照射处理,照射时间控制杀死率在90%左右，然后加入到平板培养基中28 ℃避光培养120 h，挑取水解圈直径与菌落直径比值大的菌株。

1.2.3.2NTG诱变处理。以紫外线诱变所得水解圈直径与菌落直径比值大的菌株为出发菌株，将菌株斜面孢子涂布于培养基平板(不含氯化锂和罗丹明B)上，蘸取少量NTG颗粒置于平板中央，28 ℃培养48 h后刮下抑菌圈周围的菌苔，稀释后涂布于培养基平板上，28 ℃再培养10 d，挑取水解圈直径与菌落直径比值大的菌株进行摇瓶初筛、复筛，获得高产突变株。

1.2.4吉他霉素效价测定。采用管碟法[2]。参照《中国药典》2010版附录×IA依法测定，试验用菌为枯草芽孢杆菌， 用微生物自动测量分析仪测量并计算结果。

2结果与分析

2.1菌株脂肪酶活力与产吉他霉素效价之间的关系吉他霉素产生菌菌体分泌的脂肪酶可将分离培养基中的豆油水解成甘油和脂肪酸，使罗丹明B呈粉色，产生水解圈。水解圈直径与菌落直径比值反映出脂肪酶活力的大小。选择不同生产能力的菌株涂布在分离培养基上培养，统计水解圈直径与菌落直径比值与效价的关系。

表1水解圈直径与菌落直径比值与效价的关系

Table 1Relationship between the hydrolytic circle and the colony diameter ratio and titer

菌株Stain效价Titer∥U/mL比值Ratio178601.16296501.433108651.604112641.655121161.756134621.90

植物油可提高藤仓赤霉菌合成赤霉素的能力，植物油减轻了碳代谢抑制，并有利于乙酰辅酶A和前体物供给[3-4]。植物油作为抗生素发酵碳源利用时，减轻了葡萄糖代谢所产生的抑制作用，但生产菌株脂肪酶活性的高低是影响抗生素效价提高的关键[5]。由表1可知，吉他霉素产生菌落直径与水解圈直径比值的大小与效价有一定的关系，呈正相关。也就是说，水解圈的大小反映出该菌株的效价高低，通过水解圈的大小来判断菌株的生产能力是可靠的。

2.2NTG诱变获得高产突变株经NTG诱变，挑选出10株菌，摇瓶初筛后得到5株摇瓶效价比初始出发菌株高的菌。将效价提高8%以上的菌株进行分离纯化，菌落的一部分接斜面，一部分接摇瓶考察效价。摇瓶复筛后获得1株发酵效价比出发菌株高且遗传稳定的菌株，其中最高的Zn14-12菌株的吉他霉素产量提高了10%。

2.3高产菌株遗传稳定性考察 将筛选到的突变菌株Zn14-12用群体连续传至第5代的方法考察其传代稳定性,测定每代的效价。由图1可知，菌株连续群体传至第3代斜面效价与F1代持平，第4代效价是F0代的95%，第5代降低较多，只有F0的88%，表明菌株Zn14-12的高产遗传特性是稳定的。

表1　传代次数对发酵效价的影响 Fig. 1　Effects of passage number on fermentation titer

3结论与讨论

该研究对吉他霉素产生菌株Zn14-05经紫外线和氯化锂、NTG复合诱变处理，以高脂肪酶活性为初筛指标选育吉他霉素高产突变株，缩短了选育周期，减少了初筛工作量，提高了选育效率，突变株效价比出发菌株高出10%。经连续5次群体传代和效价考察，F4发酵水平稳定在F0的95%以上。

在抗生素生物合成中,前体起着重要作用,一定条件下可控制菌体合成次级代谢产物的方向并增加其产量。吉他霉素内酯环是由5个乙酸单位、1个丙酸单位、1个丁酸单位、1个羟基乙酸单位通过与脂肪酸合成相似的聚酮体途径缩合而成[6]，短链脂肪酸作为次级代谢生物合成的前体，而在含油培养基中发酵培养时，油是短链脂肪酸产物的主要来源。脂肪酶活力高的产生菌就可能为合成次级代谢物提供更多的短链脂肪酸作为生物合成的前体。脂肪酶的水解作用是吉他霉素产生菌吸收利用豆油的第1步。该研究表明，菌株脂肪酶的活力不同，其产生吉他霉素的能力也显著不同，而且表现出明显的正相关，利用该性质，可快速判断菌株的发酵水平，指导菌种初筛，提高工作效率。

参考文献

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[6] 陈代杰．抗菌药物与细菌耐药性[M]．上海：华东理工大学出版社，2001:131.

Rapid Screening of Kitasamycin High-yield Strains with Lipase Activity as the Index

LIU Shou-qiang1, ZHAO Zhong2, WANG Xue-jie1et al

(1. Topfond Pharmaceutical Co., Ltd., Zhumadian, Henan 463000; 2. Department of Mathematics, Huanghuai University, Zhumadian, Henan 463000)

Abstract[Objective] To screen a kitasamycin high-yield strain. [Method] With streptomyces kitasatoensis Zn14-05 as an original strain, UV and NTG compound mutagenesis was adopted. Lipase activity was used as the early screening index, shake-flask screening was used to obtain the kitasamycin high-yield strain. [Result] Fermentation titer of shake-flask enhanced by 10% compared with the original strain. Passage test proved that this strain had stable genetic characteristics. [Conclusion] High lipase activity is used to screen the kitasamycin high-yield mutant strain, which shortens the breeding cycle, reduces the workload of preliminary screening, and enhances the efficiency of breeding.

Key wordsUV; Mutant strain; Kitasamycin; Lipase

基金项目国家自然科学基金NSFC-河南人才培养联合基金项目(U1304104)。

作者简介刘守强(1967- ),男，河南驻马店人，高级工程师，从事抗生素发酵工艺研究。

收稿日期2016-03-08

中图分类号TQ 465

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)12-005-02