β-内酰胺类抗生素残留分析的新型荧光检测物

王　谦，温　凯，沈建忠（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）



β-内酰胺类抗生素残留分析的新型荧光检测物

王谦，温凯，沈建忠
（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）

摘要：利用遗传编码非天然氨基酸技术（UaaTech）制备了带有荧光氨基酸（7-羟基香豆素-4-基）-乙基甘氨酸（7HC）的重组青霉素结合蛋白PBP2x-7HC。以该新型荧光检测物为基础建立的β-内酰胺类抗生素残留检测法对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、苯唑西林、双氯西林、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢匹林和头孢乙腈的最低检测限分别为0.49～2.44 ng/mL，均达到欧盟最低残留限量（MRL）标准，原奶中添加回收率为78%～102%，成品奶中添加回收率为76%～112%。该新型荧光检测物具有捕获分析物和产生检测信号的双重功能，简化了分析过程，实现了小分子物质的非竞争性免疫分析，是兽药残留检测方法的有益扩充。

关键词：β-内酰胺类抗生素；残留分析；非天然氨基酸；荧光

1　材料与方法

1.1试剂与材料限制性内切酶和DNA聚合酶，购自NEB公司；引物合成和测序在Invitrogen公司进行，pET40b载体和UaaTech工具分子质粒pE⁃VOL-7HCRS由美国SALK研究所Lei教授馈赠，分子克隆试剂盒及BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，购自天根生化科技（北京）有限公司；大鼠抗

His抗体本实验室自制，β-内酰胺类抗生素标准品，购自Sigma Aldrich，其他常规化学试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2原核表达载体的构建利用引物P1和P2 （P1：gggCATAGTaagtggacaaaaa；P2：gggCTCGAGgtctcctaaagttaa），将目的基因片段（PBP2x，Met 1-Asp 750，Δ29-49aa）扩增并亚克隆到pET40b载体中，命名为pET40b-PBP2x。利用引物P3和P4（P3：CCACGATTCGAGATtagGACGTTAATG；P4：TAATCTCGAATCGTGGCATCTGCAAT）以及全式金Fast Mutagenesis System试剂盒对pET40b-PBP2x进行点突变，将PBP2x的第374位色氨酸Trp的密码子由TGG突变为琥珀酰终止密码子TAG，经过测序验证，命名为pET40b-PBP2x_W374TAG。

1.3PBP2x-7HC重组蛋白的表达将青霉素结合蛋白表达质粒pET40b-PBP2x_W374TAG与UaaTech工具分子质粒pEVOL-7HCRS共转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌接种至5 mL含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600值达到0.8～1.0时，将培养物按1∶100稀释，继续培养至OD600值=1.4，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，阿拉伯糖终浓度0.02%，7HC至终浓度1 mmol/L，30℃下诱导4 h。离心收菌，菌体重悬于pH值8.0的PBS中，ATS细胞高压破碎仪破碎细胞，收集上清，在AKTA纯化系统中使用5 mL GE HisTrap FF预装柱纯化蛋白，蛋白命名为PBP2x-7HC，SDS-PAGE分析并用365 nm紫外光照射，拍照。

1.4非竞争性受体荧光分析法的建立

1.4.1激发波长的确定在1 mL离心管中，分别加入5 μL 0.1 mg/mL PBP2x-7HC，45 μL 1x PBS和50 μL 10 μg/mL的β-内酰胺类抗生素标准品，混匀作为测试样本；在另外1个1 mL离心管中，分别加入5 μL 0.1mg/mL PBP2x-7HC和95 μL 1x PBS，作为空白对照。测试样本和空白对照在37℃水浴放置2 h后分别吸取70 μL加入到石英杯中，使用300 nm～420 nm波长的激发光进行激发扫描，固定记录450 nm的发射光强，狭缝宽度设置为4 nm，扫描速度设置为1 nm/s，积分时间设置为0.2 s。根据激发光谱选择激发波长。

1.4.2微孔板包被浓度确定以30 μg/mL大鼠抗His抗体预处理微孔板，酪蛋白封闭后，加入PBS稀释的不同浓度的PBP2x-7HC（带有His标签）包被板孔。加入10 ng/mL氨苄西林标准品，37℃孵育2 h，洗涤后甩干，每孔加入100 μL PBS，多功能读板仪读取发射荧光强度（顶部读取，激发波长366 nm±5 nm，发射波长450 nm±10 nm）。选择信噪比最高的浓度作为包被浓度。

1.4.3灵敏度及测量范围测定根据以上确立的测试波长以及包被浓度建立微孔板荧光分析法，测量不同浓度的标准品，以标准品的荧光读数为Fa，未加标准品的空白对照的荧光读数为Fb，求得ΔF= Fb-Fa，再以ΔF为因变量，抗生素浓度为自变量，做线性回归，计算回归方程，建立标准曲线，计算最低检测限（LOD）和测量范围。最低检测限为ΔF=3SD时，标准曲线对应的抗生素浓度（SD为20个独立空白样本荧光信号的标准差）；检测范围设为ΔF=20%～80%ΔFmax时，标准曲线对应的抗生素浓度（ΔFmax为相应抗生素浓度为10 μg/mL时的ΔF）。

1.4.4特异性测定使用建立的方法测定含有10 μg/mL卡那霉素和10 μg/mL氯霉素的混合物，分析其荧光强度变化。

1.5牛奶样本的前处理0.2 mL牛奶样本加入0.56 mL PBS（pH值7.4）和0.02 mL 0.5 mol/L六氰基亚铁酸钾，充分混匀后再缓慢加入0.02 mL 1 mol/L醋酸锌，充分混匀，12 000 r/min（～13，400×g）离心2 min，取上清进行检测。

1.6牛奶样本的添加与回收在原奶和成品纯牛奶的空白样本中添加β-内酰胺类抗生素，添加浓度分别为1/2MRL、MRL和2×MRL，每个样本3个平行。以1.5的方法处理后，使用建立的方法进行测量，计算添加回收率。

图2　PBP2x-7HC SDS-PAGE分析及荧光鉴定M：蛋白分子量标准；1～4重组蛋白PBP2x-7HC

2　结果

2.1PBP2x-7HC重组蛋白的表达及鉴定蛋白SDS-PAGE分析显示，PBP2x-7HC大小为73 kD左右，与理论值相符（见图2左，两条带分别对应重组蛋白带和不带第一个氨基酸-甲硫氨酸的形式），用365 nm的紫外光照射，蛋白条带显示明亮的蓝色荧光，证明荧光氨基酸7HC确定插入到了PBP2x中（见图2右）。

2.2非竞争性受体荧光分析法的建立

2.2.1最佳工作条件的确定PBP2x-7HC结合青霉素G后，用325 nm激发，发射光强度明显增强，用366 nm激发，发射光强度显著降低，其他5种青霉素类抗生素结果相同；而当其结合头孢洛林后，无论用何种波长来激发，发射光强均减弱，其他6种头孢类抗生素结果相同（见中插彩版图3）。为统一两类抗生素的检测，我们决定以366 nm和450 nm分别作为激发和发射波长建立检测方法。包被条件优化试验显示，20 μg/mL的PBP2x-7HC得到的信噪比最高，因此使用此浓度蛋白包被微孔板。

2.2.2灵敏度和检测范围使用以上建立的方法检测不同浓度的β-内酰胺类抗生素的标准品，得到该方法的最低检测限（LOD）和检测范围见表1。青霉素G等13种抗生素的最低检测限分别为0.49～2.44 ng/mL，均达到欧盟最低残留限量（MRL）标准。

表1　β-内酰胺类抗生素的最低检测限和检测范围

表2　β-内酰胺类抗生素在原奶和成品奶中的回收率

2.2.3特异性测定使用建立的荧光检测法检测氯霉素和卡那霉素混合物，其荧光强度变化与PBS带来的背景测量噪声相当（结果未示），说明PBP2x-7HC保持了青霉素结合蛋白的特异性。

2.2.4牛奶样本的添加与回收分别在空白原奶和成品奶样本中添加不同浓度的β-内酰胺类抗生素，添加回收率结果见表2。原奶中回收率为78%～102%，成品奶中回收率为76%～112%。

3　讨论

灵敏的抗生素残留检测在食品安全、耐药菌控制、器官保存及移植等多个领域具有非常重要的意义[2]。荧光作为一种灵敏度极高的信号被广泛应用于化学分析、生物检测以及光学成像中[3]。非天然氨基酸7HC的荧光对环境变化反映灵敏，分子却只有一个氨基酸残基大小，可以被灵活放置到蛋白质不同位点。借助UaaTech工具分子及晶体结构分析，我们将7HC以遗传编码的方式引入到青霉素结合蛋白底物结合区域W374位置[4-5]，制备了一种新型的荧光检测物，并以此建立了一种灵敏的荧光分析法用于检测β-内酰胺类抗生素残留。该法对氨苄西林等13种β-内酰胺类抗生素的检测限均低于欧盟的最大残留限，并可应用于牛奶样本的检测。此新型荧光检测物将传统检测方法中的捕获和信号物质统一为一种试剂，简化了试剂制备和分析过程，并且以此为基础，可以实现小分子物质的非竞争性检测，有助于发展更加精确，更加稳定的检测手段，是兽药残留检测方法的有益扩充。迄今为止，带有各种荧光基团的非天然氨基酸在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中被成功地引入到各类蛋白质中，并可大量生产[6]。我们有理由相信，利用荧光氨基酸来发现和检测各种与蛋白相互作用的小分子物质必将在食品、环境和临床医学上得到越来越广泛的应用。

参考文献：

[1] Koopmans T，van Haren M，van Ufford L Q，et al.A concise prep⁃aration of the fluorescent amino acid L-（7-hydroxycoumarin-4-yl）ethylglycine and extension of its utility in solid phase peptide synthesis[J].Bioorg Med Chem，2013，21（2）：553-559.

[2] Buzzi M，Guarino A，Gatto C，et al.Residual antibiotics in decon⁃taminated human cardiovascular tissues intended for transplanta⁃tion and risk of falsely negative microbiological analyses[J] .PLoS One，2014，9（11）：e112679.

[3] Loving G S，Sainlos M，Imperiali，B.Monitoring protein interactions and dynamics with solvatochromic fluorophores[J].Trends Biotechnol，2010，28：73-83.

[4] Yamada M，Watanabe T，Baba N，et al.Crystal structures of biap⁃enem and tebipenem complexed with penicillin-binding proteins 2X and 1A from Streptococcus pneumoniae[J] .Antimicrob Agents Chemother，2008，52（6）：2053-2060.

[5] Lacey V K，Parrish A R，Han S，et al . A fluorescent reporter of the phosphorylation status of the substrate protein STAT3[J] . An⁃gew Chem Int Ed Engl，2011，50（37）：8692-8696.

[6] Wang Q，Parrish A R，Wang L . Expanding the genetic code for biological studies[J].Chem Biol，2009，16（3）：323-336.

中图分类号：R 927.1

文献标志码：B

文章编号：0529-6005（2016）05-0084-03

收稿日期：2015-11-09

作者简介：王谦（1978-），男，博士，从事食品中兽药残留检测，E-mail：547596669@qq.com

通讯作者：沈建忠，E-mail：SJZ@cau.edu.cn当今抗生素残留快速监测技术的主流是以抗原-抗体或者受体-配体反应为基础的竞争性免疫分析法。此类方法设备相对简单、使用方便，但存在着竞争物标记困难、均一度难以控制、准确度不够高的问题。如何实现抗生素这类小分子的非竞争性免疫分析，简化试剂制备，提高方法的准确性和稳定性，一直是科研工作者努力的目标。利用遗传编码非天然氨基酸技术，我们尝试将荧光氨基酸7HC（见中插彩版图1a）定点插入到青霉素结合蛋白PBP2x的抗生素结合区域，制备一种新型荧光检测物，利用7HC荧光强度对微环境pH值和极性敏感的特性[1]，直接反映PBP2x与抗生素结合后所引起的底物结合区域微环境的变化（见中插彩版图1b），从而建立β-内酰胺类抗生素残留分析方法。