5种中药对常见皮肤癣菌抑菌效果评价

杨晓伟，于　欢，古少鹏，唐　芳，王仲兵，冯爱梅（.山西农业大学动物科技学院，山西太谷0080；.山西省动物疫病预防控制中心，山西太原0007；.汾阳市畜牧局，山西汾阳000）



5种中药对常见皮肤癣菌抑菌效果评价

杨晓伟1，于欢1，古少鹏1，唐芳1，王仲兵2，冯爱梅3
（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西省动物疫病预防控制中心，山西太原030027；3.汾阳市畜牧局，山西汾阳032200）

摘要：比较了水提法与醇提法对苦参、土荆皮、白鲜皮的提取率，参照美国临床实验室标准化委员推荐丝状真菌药敏性实验方案（CLSI M38-A2）分别测定苦参、土荆皮、白鲜皮、瑞香狼毒和蜂胶提取物的对犬小孢子菌、红色毛癣菌和须毛癣菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），以期为药物研究提供依据。结果显示：苦参、土荆皮、白鲜皮醇提取法提取率分别为4.317%、7.803%和9.162%，是水提取法的两倍以上；苦参、土荆皮和白鲜皮乙醇提取物对3种皮肤癣菌的MBC均低于水提取法；蜂胶、狼毒、苦参、白鲜皮和土荆皮醇提取物对3种皮肤癣菌均有良好的杀灭作用，其中以蜂胶的MIC和MBC最低，分别为0.4692 mg/mL～0.93850 mg/mL和0.9385 mg/mL～1.887 mg/mL。

关键词：中药；皮肤癣菌；CLSI M38-A；抑菌效果

皮肤癣菌病是指由皮肤癣菌引起的表皮（角质层）、毛发、甲板等组织的感染，临床症状表现手足癣、体股癣、头癣等；常见致病菌有须毛廯菌、犬小孢子菌和红色毛廯菌等[1]。目前治疗皮肤癣菌病主要药物有抗真菌抗生素，糖皮质激素和免疫抑制剂，这些药物虽有一定的疗效，但存在抗菌谱窄、易产生耐药性、毒副作用和促使免疫力降低等问题[2-3]。中草药来源广泛、抗真菌化学成分多，不易产生耐药性和毒副作用小而引起人们重视。研究发现，土荆皮、白鲜皮和地肤子等水提取物和乙醇提取物对白色念珠菌和糠秕马拉色菌具有较强抑制活性[4]，蜂胶能够使细胞壁通透性增强从而发挥抑菌效应[5]，中药复方可明显增强抗真菌作用[6]。因此，研究单味中药的抗真菌活性对抗真菌复方的研究有重要的意义。

为了探讨5种中药不同提取物对常见感染性真菌的抑菌活性，本试验依据美国临床实验标准委员会（CLSI）提出方案M38-A[7]，测定了其对犬小孢子菌、须毛癣菌和红色毛癣菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），以期为进一步研制具有临床应用价值的抗真菌中药制剂提供依据。

1　材料与方法

1.1中药苦参（产地四川、批次080303）；白鲜皮（产地山东、批次081001）；土荆皮（产地浙江、批次081205），均购自太谷县仁和大药房。狼毒乙醇提取物、蜂胶（山西农业大学曹挥、姜玉锁教授惠赠）。

1.2菌种犬小孢子菌、红色毛廯菌、须毛癣菌，均由山西农业大学预防兽医实验室分离和按照郭鹏豪[8]鉴定。

1.3主要仪器和试剂超净工作台（苏净JJ-CT-2FD），立式压力蒸汽灭菌锅，旋转蒸发器（RE-52AA），循环水浴多用真空泵，恒温振荡器（THZC），血细胞计数板，96孔酶标板，无水乙醇（批号20141112），RPMI-1640培养液（购自Invitrogen公司）和沙堡劳葡萄糖琼脂培养基（SDA，购自青岛海博生物有限公司）。

1.43种中药有效成分的粗提取

1.4.1乙醇法提取中药白鲜皮、土荆皮和苦参分别用10倍、8倍和5倍的无水乙醇回流提取，旋转蒸发仪回收乙醇，得提取浸膏，干燥后称量，计算提取率，于4℃冰箱保存。

按公式计X=[w-w1/w]×100%（X表示提取率；W表示样品重量；W1残渣重量）计算提取率。

1.4.2去离子水提取中药白鲜皮、土荆皮和苦参分别用20倍、15倍和4倍的去离子蒸馏水浸泡，在砂锅中煮沸提取，旋转蒸发仪浓缩，干燥后称量，按照1.4.1计算提取率，在4℃冰箱保存。

1.5菌液制备[9]将受试菌接种在SDA培养基，在27℃下培养7 d使其活化，取1 mL的生理盐水加入试管，用吸管反复轻轻抽吸后，用滤纸渗漏含有孢子和菌丝片段的菌悬液，转入EP管中，通过比浊仪调整菌悬液为0.2～0.3麦氏单位，并用血细胞计数板计数验证达（1-3）×105CFU/mL，取部分菌悬液用生理盐水稀释100倍，吸取0.01 mL菌悬液接种至SDA上，于27℃下孵育和培养，每天观察有无菌落形成。

1.6中药提取物体外抑菌活性的试验参照CL⁃SI提出的丝状真菌的药物敏感方案，将用RPMI-1640稀释好的中药提取物加入96孔酶标板中，采用MA-38-A2液体微量稀释法，测定苦参、土荆皮、白鲜皮乙醇提取物和水提取物以及蜂胶、狼毒乙醇提取物对犬小孢子菌、须毛癣菌和红色毛癣菌的MIC，并设立灰黄霉素治疗组、阳性和阴性对照组，药物试验组无真菌生长视为MIC。采用SDA琼脂平板法测定中药提取物对各受试菌的MBC值；经28℃培养7 d，在SDA培养基上肉眼观察无真菌生长，视为MBC。

2　结果

2.13种中药提取率苦参、土荆皮、白鲜皮醇提取法提取率分别达到4.317%、7.803%和9.162%，为水提取法的两倍以上，见图1。

图1　3种中药的提取率

2.25种中药提取物的MIC和MFC苦参和土荆皮乙醇提取物对3种皮肤癣菌的MIC分别为1.509 mg/L～3.018 mg/L和2.033 mg/L～4.067 mg/ L，均低于水提物；白鲜皮醇提取物对须毛癣菌和红须毛癣菌的MIC分别为4.537 mg/L和2.268 mg/ L，高于水提物；狼毒和蜂胶醇提取物MIC和MBC均低于苦参、土荆皮和白鲜皮提取物；5种中药醇提取物的MBC为MIC的2～4倍，水提物的MBC 为MIC的2～8倍，5种中药提取物在该浓度下抑菌和杀菌效果与灰黄霉素相同，详见表1。

表3抗真菌药物的MIC和MBC值（mg/L）

3　讨论

液体培养基稀释法、琼脂稀释法和琼脂扩散法是评价抗真菌药物药效常用的方法，其试验结果受诸多因素的影响，包括菌悬液的浓度，培养基成分、孵育温度和时间以及不同终点判定方法，目前缺少标准测定皮肤癣菌的试验方案，针对皮肤癣菌且被广泛认可的试验方法正在不断探索，笔者根据CLSI M38-A2方案，同时结合陈剑等皮肤廯菌药敏试验结果及本试验的前期的摸索，筛选出真菌药敏试验条件：菌种在SDA固体培养基27℃培养7 d，菌液浓度为（1-3）×105CFU/ mL，微量板置于湿盒里培养可获得稳定的结果。

中药传统提取方法有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法，其中水煎煮法和乙醇浸渍法是常用的方法。本研究发现乙醇浸责法提取率优于水煎煮法，主要原因在于中药有效成分的热敏性和极性不同；苦参、土荆皮和白鲜皮的主要活性成分分别为苦参碱、土荆皮酸B和白鲜碱，依据相似相溶原理，乙醇有利于提取各中药的有效成分，更好地发挥其抗真菌的作用，同时由于水煎法温度高可使某些中药活性物质分解[10]。

5种中药乙醇提取物对犬小孢子菌、须毛癣菌和红色毛癣菌均显示了良好的抑菌活性，其中蜂胶乙醇提取物抑菌活性最高，其MIC范围为0.4692～0.9385 mg/mL，MFC范围为0.9385～1.887 mg/mL，并且与灰黄霉素抑菌浓度接近；土荆皮抑菌活性最低，MIC范围为3.137～6.275 mg/mL，MBC范围为6.275～12.55 mg/mL。体外抑菌试验表明，5种中药乙醇提取物对犬小孢子菌、须毛癣菌和红色毛癣菌的杀菌效果优于水提物；蜂胶乙醇提取物能够在较低浓度下抑制和杀死真菌，与常用抗真菌药灰黄霉素浓度相近，显示了优良的杀菌效力；瑞香狼毒其毒性较大，在临床上容易引起毒性反应和过敏性反应[11]，正确评价瑞香狼毒的毒性可为临床试验提供依据。

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A study on theanti-dermatohytic potential of five medicineplants against thedermatophytes

YANG Xiao-wei1，YU Huan1，GU Shao-peng1，TANG Fang1，WANG Zhong-bing2，FEN Ai-mei3
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Center for Animal Disease Control and Prevention Shanxi，Taiyuan 030024，China；3.Fenyang County Animal Husbandry Bureau，Fenyang 030020，China）

Abstract：To provide a basis for the further drug study，we compared the ratio of ethanol and water extractives to radix sopho⁃rae flavescentis，cortex pseudolaricis，and cortex dictamni，and evaluated the antifungal activity from Stellera chamaejasme L.eu⁃phorbia，radix sophorae flavescentis，pseudolaricis cortex，cortex dictamni and propolis against the microsporum canis，trichophy⁃ton mentagrophytes，and trichophyton rubrum by the protocol of CLSI M38-A2.The results showed that for the three Chinese medi⁃cines，the ratio of ethanol extractives was 4.317%、7.803% and 9.162%，respectively，which was twice as high as the ratio of water extractives.The minimal bactericdal concentration（MBC）of ethanol extractives was lower than the water extractives.The ethanol ex⁃tractives of the five medicines had an effort on inhibiting the dermatophytes，of which the propolis was the best，and the range of MIC and MBC was 0.4692 mg/mL～0.93850 mg/mL and 0.9385 mg/mL～1.887 mg/mL.

Key words：traditional chinese medicine；dermatophytes；CLSI M38-A；antifungal activity

中图分类号：S859.3

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0069-03

收稿日期：2015-03-02

基金项目：山西省科技攻关项目（20130311028-3，201303110-25-3）；“十一五”国家科技支撑计划（2007BAD56B06-5）

作者简介：杨晓伟（1988-），男，硕士，主要从事兽医公共卫生与人畜共患病防治研究，E-mail：769936463@qq.com

通讯作者：古少鹏，E-mail：shpgu@163.com

Corresponding author：GU Shao-peng