水貂阿留申病粪便中DNA的提取方法及与产仔数的相关性

白蕙箐，李洪萍，朱婉月，郭宫德，白秀娟（.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨5000；.吉林农业大学中药材学院，吉林长春08；.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨5000）



水貂阿留申病粪便中DNA的提取方法及与产仔数的相关性

白蕙箐1，李洪萍2，朱婉月3，郭宫德1，白秀娟1
（1.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030；2.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118；3.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）

水貂阿留申病（Aleutian disease of mink），又称浆细胞增多症（Plasmacytosis），是由细小病毒科的阿留申病病毒（ADMV）引起的一种慢性传染病，导致自身免疫系统紊乱并逐渐衰竭，并发强烈的自身免疫。主要侵害网状内皮系统，其特征为浆细胞弥漫性增生、产生多量C-球蛋白和持续性的病毒血症。水貂阿留申病具有自身免疫和超敏现象，并伴有动脉血管炎、肾小球肾炎以及卵巢、睾丸等炎症变化。该病使母貂空怀、流产、不发情、弱胎，公貂精子活力、配种能力降低，导致繁殖率低，皮毛质量差，死亡率高，造成严重的经济损失[1]。

水貂阿留申病在许多水貂养殖地区广泛流行，是当前威胁养貂业发展的主要疫病之一。最早发现于1946年，至今已经广泛流行于欧、美、亚的20多个国家，在我国，阿留申病普遍存在于全国各个貂场，某些地区感染率甚至高达80%[2]。该病为慢性传染病，潜伏期长，发病前期症状不明显，因此容易被忽视，从而导致检疫力度不够，病貂未能及时淘汰。病毒通过病貂的排泄物等排出体外，污染环境，感染其他健康水貂，引起该病大面积流行。阿留申病的主要传染源是病貂和潜伏期病貂。目前还没有从根本上治疗阿留申病的药物，只有通过加强检测预防来控制阿留申病的传播。

对水貂阿留申病的检测多为采血或组织取样，但由于水貂经济动物的特殊性，采血和取样对其经济价值有较大影响，以至产生经济损失。笔者采用水貂粪便检测方法，研究牡丹江某貂场水貂阿留申病的发病情况并验证其对产仔数的影响。

1　材料与方法

1.1试验材料粪便样品由牡丹江某水貂养殖场提供。

1.2试验仪器手术剪、镊子；1.5 mL离心管；微量移液器，恒温水浴锅，PL2002型电子天平；TGL-16GA型高速离心机，温度梯度PCR仪，电泳仪，对流电泳槽，凝胶成像系统。

1.3主要试剂PBS缓冲液，Taq DNA聚合酶，dNTPs（购自哈尔滨海基生物科技有限公司），10× Buffer（购自北京全式金生物技术有限公司），Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）。

本试验所使用的引物是参照Qie等[3]1996年使用的引物。引物序列为：

上游：P1：5′-CTTGTCACGCTACTAGAATGGT-3′（2 587 bp～2 609 bp）

下游：P2：5′-AGCTTAAGGTTAGTTTACATG⁃GTTTACT-3′（3 252 bp～3 279 bp）

引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，扩增的目的片段长度是693 bp。

1.4试验方法

1.4.1样品采集随机选择貂场产子胎数、生长状况相近的雌性水貂，取其粪便样品于独立密封袋中，按其产子数分为两组：高产仔数组（产仔数≥7只）30只，随机平均分为3组；低产仔数组（产仔数≤3只）30只，随机平均分为3组。于-20℃冷冻保存备用。

1.4.2样品预处理取0.3 g样品放入灭菌的1.5 mL离心管中，加入1 mL的PBS缓冲液，充分震荡5～10 min。3 000 r/min离心5 min，将上清液移至新离心管中。将上清液6 000 r/min离心5 min，收集上清液于新的离心管中。

1.4.3DNA提取加入0.6 μL溶液A到上一步得到的样品中，振荡30 s混匀后，室温放置10 min。将溶液转移到吸附柱中，室温放置2 min，12 000 r/min离心1 min，弃穿透液，把吸附柱放回收集管内。加0.7 μL通用洗柱液到吸附柱内，12 000 r/min离心1 nin，弃穿透液。12 000 r/min离心1 min后弃离心管。将吸附柱套入一个新的1.5 mL离心管中，在吸附柱的滤膜中加入30 μL DNA洗脱液，室温放置2 min。12 000 r/min离心1 min，即得DNA溶液。

1.4.4PCR扩增将提取的病毒DNA进行PCR扩增，反应体系为25 μL。扩增程序为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 nin，循环35次；72℃再延伸7 min，4℃保存。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2　结果与分析

2.1水貂阿留申病病毒粪便提取结果选取患病水貂粪便，根据上述方法，提取粪便中阿留申病病毒的DNA结果可见图1。扩增的目的片段长度为693 bp，PCR扩增产物介于500 bp～750 bp之间，与预期结果相符。

图1　从粪便中提取的阿留申病病毒DNA PCR扩增电泳结果M：DL-2 000分子量标准；1～6：PCR产物

2.2水貂阿留申病对产仔数影响分析结果所采粪样进行阿留申病病毒DNA提取后，对提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物长为693 bp。用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图2、3。

图2　低产仔数组阿留申病病毒DNA PCR扩增电泳结果M：DL-2 000分子量标准；K：空白对照；1～5：PCR产物

两组水貂阿留申病带毒率见表1，对两组数据进行比对，利用SPSS 20.0软件处理试验数据，结果显示，高产仔数组与低产仔数组带毒率的差异显著（P<0.05）。所以，水貂阿留申病对水貂产仔数的降低有影响。

图3　高产仔数组阿留申病病毒DNA PCR扩增电泳结果M：DL-2 000分子量标准；K：空白对照；泳道1～10：PCR产物

表1　两组水貂阿留申病带毒率

3　讨论

3.1粪便提取DNA通过采血或者组织取样的方式进行水貂阿留申病的检测，对被检水貂个体造成一定伤害，不利于其经济价值的保护。本试验利用粪便DNA提取技术，从患病水貂粪便中成功提取阿留申病病毒DNA，通过PCR扩增和电泳检测得到清晰明亮的条带，利用该方法可以进行阿留申病的检测。刘维全[4]用ELISA法，成功的在水貂粪便中检测出冠状病毒和呼肠孤病毒。谭斌等[5]利用患病水貂粪便，通过血清学鉴定、PCR鉴定等试验，分离出水貂病病毒性肠炎的强毒株。以往的试验均证明从水貂粪便中提取病毒DNA的方法切实可行，与本试验结果相符。该方法不仅操作简便，而且对被检水貂不会造成干扰和伤害，将经济损失降到最小化，有很高的应用价值，为水貂阿留申病的检测提供了新的检测手段。

3.2水貂阿留申病对产仔数的影响本试验结果显示，高产仔数组阿留申病带毒率低于低产仔数组水貂带毒率，两组水貂带毒率差异显著（P< 0.05）。表明水貂阿留申病对产仔数有一定影响，患病水貂产仔数下降。李增光[6]报道，阿留申病使养貂产仔率下降30%左右。宋月峰[7]表述，阿留申病会导致母貂空怀率和死胎率上升，平均产仔数下降。籍玉林等[8]研究表明，阿留申病阳性母貂的窝产仔数和窝均存活数均低于阴性母貂。以往试验结果均与本试验结果相符。分析原因，可能是水貂阿留申病对感染水貂的生殖系统有很大影响和损伤，引起公貂精子水平下降，母貂空怀、流产、不发情等，从而造成产仔数的下降。基于本试验研究中样本含量较少，在本试验基础上，有待通过提高样本量进行深入研究从而得出更切实可靠的结论。

参考文献：

[1]赖坤宏，乔忠，孙世兴，等.水貂阿留申病流行病学调查报告[J].中国兽医科技，1985（11）：20-21.

[2]陈超然，温建新.威海某地区水貂阿留申病的诊断与调查[J].天津农业科学，2014，20（4）：17-20.

[3] Oie K L，Durrant G，Wolfinbarger J B，et al.The relationship be⁃tween capsid protein（VP2）sequence and pathogenicity of Aleu⁃ tian mink disease parvovirus（ADV）：a possible role for raccoons in the transmission of ADV infections[J] . Journal of virology，1996，70（2）：852-861.

[4]刘维全，韩慧民.水貂肠道冠状病毒和呼肠孤病毒的病原性及在腹泻中的作用[J].黑龙江畜牧兽医，1993（12）：27-29．

[5]谭斌，陈微晶，武华.致病性水貂肠炎病毒MEV-ZJ1株的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医，2011，38（2）：149-152．

[6]李增光.水貂阿留申病[J].中国动物检疫，1985，15．

[7]宋月峰，宋晓东，王晓龙.水貂阿留申病的防治[J].中国动物保健，2013，15（4）：69-70．

[8]籍玉林，曲维江.水貂阿留申病循环免疫复合物含量与抗体水平对产仔成活的影响[J].中国兽医学报，1995，15（3）：224-227.

中图分类号：S865.2+2

文献标志码：B

文章编号：0529-6005（2016）05-0054-02

收稿日期：2015-01-23

作者简介：白蕙菁（1990-），女，硕士，研究方向为动物养殖，E-mail：huiqing_bai@163.com

通讯作者：白秀娟，E-mail：bxj630306@163.com