梅花鹿发情期阴道细胞形态变化与最适输精期

韩欢胜，赵列平，柴孟龙，徐　馨，高　利（.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨5000；.黑龙江省农垦科学院哈尔滨特产研究所，黑龙江哈尔滨5008；.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔6006）



梅花鹿发情期阴道细胞形态变化与最适输精期

韩欢胜1，2，赵列平2，柴孟龙2，徐馨3，高利1
（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省农垦科学院哈尔滨特产研究所，黑龙江哈尔滨150038；3.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161006）

摘要：为了对梅花鹿进行准确的发情鉴定和适时输精，本试验对梅花鹿发情期阴道细胞进行涂片检查和发情时期划分，并按划分时期进行了输精试验。通过研究形成了梅花鹿发情前期、发情盛期、发情末期与间情期阴道细胞检查图谱，总结出了各时期阴道细胞变化规律。发情期各阶段输精结果，发情盛期的Ⅰ期到Ⅲ期受胎率分别是83.3%、86.5%、79.1%，受胎率明显高于发情期输精总的受胎率71.5%，确定梅花鹿普通冻精输精最适时期是发情盛期（Ⅰ期-Ⅲ期）。研究表明，梅花鹿阴道细胞发情鉴定是提高梅花鹿人工授精受胎率的一种新的有效方法。

关键词：梅花鹿；发情期；阴道细胞；形态变化；最适输精

准确的发情鉴定对提高动物繁殖生产意义重大。目前，哺乳动物发情鉴定方法有行为观察法、公兽试情法、阴道细胞学检查法、阴道电阻测定法、生殖激素含量测定法、唾液结晶检查法等多种方法[1-5]。梅花鹿属季节性周期多次发情动物，发情鉴定目前主要采用公鹿试情行为观察的方法，由于其生性胆小，发情行为隐蔽，采用该法一般很难确定发情所处阶段，给适时配种或输精增加了难度。为进一步提高情期受胎率，本研究对梅花鹿发情不同阶段阴道细胞进行了形态学检查和时期划分，并按划分时期进行了输精试验。

1　材料

1.1实验动物用于发情期阴道细胞检查和人工输精的鹿，北京市怀柔区喇嘛沟门西府营乡梅花鹿场提供56头，富裕县梅花鹿场提供83头。

1.2试验器械、药品载玻片、医用棉签、75%酒精、生理盐水、光学显微镜（带显微摄像头）、鹿眠宝、鹿醒宁（青岛汉河集团）、消毒毛巾、日式输精枪、梅花鹿常规冻精。

2　试验方法

2.1梅花鹿阴道细胞检查及时期划分用公鹿试情方法进行母鹿发情鉴定，将发情的母鹿每隔2 h进行1次麻醉，用消毒毛巾擦净外阴，用生理盐水将消毒后的棉签蘸湿，顺着阴道上侧壁，边捻转边插入，到10 cm左右深度时，贴着阴道上侧壁捻转3～4次，顺着上侧壁慢慢拉出。然后在洁净的载玻片上从一边开始，转动棉签将阴道黏液均匀的涂抹在载玻片中央，自然风干后在16×40倍显微镜下检查发情期阴道细胞形态，并结合发情行为和细胞形态特点划分发情时期。

2.2梅花鹿输精适期确定用阴道细胞检查方法对发情期各阶段进行冻精人工输精试验，每次输0.25 mL细管冻精1支，解冻后有效精子数≥1 000万个，活力≥0.3。然后根据各时段输精母鹿的受胎率情况来确定最适输精时间。

3　结果与分析

3.1梅花鹿发情期各阶段阴道细胞变化按副基细胞、有核角化细胞、无核角化细胞出现和转化情况将发情期分为发情前期、发情盛期和发情末期，并对各期进行了Ⅰ期到Ⅲ期的具体细化，总结了发情期各期细胞变化特点。为区别对照发情期与间情期细胞变化，对间情期阴道细胞形态变化也进行了检查。

3.1.1发情前期阴道细胞变化发情前期Ⅰ期，母鹿处于发情前期的早期，刚接受公鹿爬跨，溜圈，阴道细胞特征是副基细胞散在稀疏，主要是小中间细胞（图1左图箭头表示）。发情前期Ⅱ期，母鹿处于发情前期的中期，接受公鹿爬跨，外逃，阴道细胞特征是副基细胞增多，小中间细胞多于大中间细胞（图1中图箭头所示），血小板增多，均匀分布。发情前期Ⅲ期：母鹿处于发情前期的晚期，接受公鹿爬跨，外逃，阴道细胞特征是副基细胞增多，其中大中间细胞（图1右图箭头所示）多于小中间细胞，血小板密集。在160～640倍显微镜下，血小板可检查到，但图像经过转换后血小板在图片上呈现不清晰，与细胞分层观察有关，以下各期图片效果相同。

3.1.2发情盛期阴道细胞变化发情盛期Ⅰ期：母鹿处于发情盛期的早期，接受公鹿爬跨，阴道细胞特征是有核角化细胞（图2左图箭头所示）开始出现增多，副基细胞多于有核角化细胞，并以大中间细胞为主，血小板密集。发情盛期Ⅱ期，母鹿处于发情盛期的中期，接受公鹿状态为一爬一走，阴道细胞特征是有核角化细胞（图2中图长箭头所示）多于副基细胞，副基细胞以大中间细胞（图2中图短箭头所示）为主，血小板开始减少。发情盛期Ⅲ期：母鹿处于发情盛期的晚期，拒绝公鹿爬跨，阴道上皮细胞特征是出现大量红细胞（2右图箭头所示），大量有核角化细胞，少量副基细胞（大中间细胞为主），血小板散在稀疏。

3.1.3发情末期阴道细胞变化发情末期Ⅰ期：母鹿处于发情末期的早期，拒绝公鹿爬跨，阴道细胞特征是中量红细胞，中量无核角化细胞（图3左图长箭头所示），极少量副基细胞（以大中间细胞为主），血小板特别稀疏。发情末期Ⅱ期：母鹿处于发情末期的中期，拒绝公鹿爬跨，阴道细胞特征是中量无核角化细胞（图3中图长箭头所示），副基细胞（小、大中间细胞）又开始增多，少量红细胞（图3中图短箭头所示），细胞开始聚集。发情末期Ⅲ期：母鹿处于发情末期的晚期，拒绝公鹿爬跨，阴道细胞特征是副基细胞（小、大中间细胞）中量，少量无核角化细胞，出现少量细胞碎片，细胞聚集呈云雾状。

图1　发情前期阴道细胞变化（×640）

3.1.4间情期阴道细胞变化间情期，母鹿拒绝公鹿爬跨，性兴奋转为安静，阴道细胞特征是零星的副基细胞，且主要是大中间细胞（图4左图），或只见细胞碎片（图4右图），或零星的副基细胞与细胞碎片同时出现（图4中图）。

3.2最适输精时间梅花鹿普通冻精输精发情期各阶段受胎情况见表1，输精受胎集中时间是发情前期Ⅲ期到发情末期的Ⅱ期，受胎率依次是31.3%、83.3%、86.5%、79.1%、53.3%、20.0%，其中输精受胎率最高阶段是发情盛期的Ⅰ期至Ⅲ期，受胎率分别是83.3%、86.5%、79.1%，比总受胎71.5%分别高15.0%、7.6%，说明发情盛期的Ⅰ期至Ⅲ期是梅花鹿普通冻精输精最适时间。

图3　发情末期阴道细胞变化（×640）

4　讨论

图4　间情期阴道细胞变化（×640）

表1　发情期各阶段人工输精效果

4.1梅花鹿排卵过程与阴道细胞变化关系试验认为梅花鹿阴道细胞的来源，主要由阴道上皮细胞和排卵过程中产生的细胞组成。细胞形态的变化主要由生殖激素雌激素和孕激素作用引起。梅花鹿发情期阴道内细胞变化本研究认为由两条途径调节，一条途径是，排卵过程引起的细胞变化。鹿进入发情季节，卵泡雌激素分泌增多，在雌激素的反馈作用下，垂体前叶LH分泌增加，FSH分泌减少，使排卵前出现LH峰，进而激发卵泡产生一系列的理化变化，最终引发卵泡膜变薄、充血、破裂与排卵，通过分泌物引起阴道内细胞的变化，在阴道细胞检查中出现的红细胞、血小板就是由卵泡充血渗出血液（主要是血小板）和破裂时流出的液体引起的。另一条途径是，通过血液中雌激素和孕激素周期的改变引起阴道上皮细胞变化。

4.2低倍镜下不规则图像出现原因阴道分泌物涂片在低倍显微镜（16×10倍）肉眼观察到不规则形状出现原因。涂片在低倍显微镜视野内细胞会出现散点状、雪松状、雪花状、云雾状等图像。本试验认为与“血小板卫星现象”有关[6]。“血小板卫星现象”是在涂片中血小板粘附于白细胞周围，在显微镜下呈现簇状聚集的现象。在鹿阴道细胞检查中当临近排卵前后，卵巢组织受损，白细胞增多，发情前期和发情盛期出现了嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞；另外卵泡血液渗出或排卵出血时，会出现大量的血小板，这样血小板和白细胞的按不同比例混合，经过“血小板卫星现象”，形成了各种观察图像。

4.3输精剂量与受胎率的关系梅花鹿是阴道射精型动物，精子到达输卵管壶腹部受精，需穿过子宫颈、宫管连接部、输卵管壶腹部和狭部连接部等栅栏，本交射精上亿个但到达壶腹部的精子只有几百个。人工输精时精子数不能低于某一限度，才可保证壶腹部有足够的用以受精的精子。绵羊正常一次射精约有30亿个精子，但通过子宫颈者却少于100万个[1]；在牛的繁殖上每次输精剂量是≥800万有效精子[7]；目前，鹿冷冻精液还没有国标，赵列平等输精试验表明[8]，梅花鹿性控冻精（解冻后有效精子数100～120万）与普通冻精（有效精子数≥1 000万）输精情期受胎率60.76 %、61.63 %，两者间无显著差异（P>0.05），说明梅花鹿人工输精有效精子数120万就可保证受胎。本试验使用的冻精有效精子数≥1 000万，输精部位跃过子宫颈，这样保证了有足够的精子到达输卵管壶腹部，并受精。

4.4最适输精时间最适输精时间由排卵时间、精子受精能力、精子获能时间等多个因素共同决定，使用冻精输精，准确的发情鉴定是确定最适输精时间的关键[9-13]。目前，梅花鹿人工输精主要采取公鹿试情结合行为观察或采用同期发情定时输精的方法，往往因个体差异，采用上法很难确定最佳时间，本研究通过阴道细胞检查方法，增强了发情鉴定判定的准确性，结合公鹿试情可明显提高梅花鹿受胎率。

5　结论

本试验形成了梅花鹿发情期阴道细胞检查图谱，总结出了阴道细胞检查发情鉴定规律。应用阴道细胞发情鉴定技术确定了梅花鹿普通冻精输精最适时期是发情盛期（Ⅰ期-Ⅲ期），阴道细胞发情鉴定技术作为一种新的方法可应用于梅花鹿繁殖生产。

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Vaginal Cell Morphological Changes in Estrus and the Best Inseminating Timeon Sika Deer

HAN Huan-sheng1，2，ZHAO Lie-ping2，CHAI Meng-long2，XU Xin3，GAO Li1
（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Harbin Specialty Research Institute，Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences，Harbin 150038，China；3.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161006，China）

Abstract：To identify estrus accurately and start artificing insemination timely on the sika deer，we performed a complete study on the observation of sika deer vaginal cell smear using microscop . Our results summarized the vaginal cell examination plates and transformation law in proestrus，vigorous estrus，and late estus and diestrus.We showed that artificing insemination time of the sika deer was in vigorous estrus stage from ItoIII，and the conception rates of artificial insemination were 83.3%，86.5%，and 79.1% from I stage toIII，respectively，which are obviously higher conception rate in each vigorous estrus stage than the general conception rate（71.5%）in estres period.These data indicate that it is a new effective method to improve the conception rate of arti⁃ficial insemination by identifying the vaginal cells on estrus sika deer.

Key words：Sika Deer；Estrus；Vaginal Cell；Morphological Changes；The Best Inseminating Time

中图分类号：S825

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0028-04

收稿日期：2015-05-26

基金项目：黑龙江省应用技术研究与开发计划项目（GC13B-（GC13B407）；黑龙江省农垦总局攻关项目（HNKIV-08-12A，HNK125B-12-05）；哈尔滨市科技创新项目（2015RQQYJ033）

作者简介：韩欢胜（1978-），男，副研究员，硕士，从事动物医学工作，E-mail：hanhuansheng@aliyun.com

通讯作者：高利，E-mail：gaoli43450@163.com

Corresponding author：GAO Li