猪FcγRIII双抗体夹心ELISA方法的建立及其在PRRSV感染猪中的初步应用

谷伟红，郭龙军，牛军伟，田志军，冯　力，王玉娥

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）



猪FcγRIII双抗体夹心ELISA方法的建立及其在PRRSV感染猪中的初步应用

谷伟红，郭龙军，牛军伟，田志军，冯力，王玉娥

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）

摘要：利用自行制备的FcγRIII多克隆抗体作为捕获抗体，鼠源抗FcγRIII特异性单克隆抗体作为示踪抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统，建立了检测可溶性FcγRIII（sFcγRIII）水平的双抗体夹心ELISA方法。利用建立的该ELISA方法对感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）血清进行检测，结果显示，猪感染PRRSV后，血清中sFcγRIII的水平明显增高，因此sFcγRIII的水平可能作为PRRSV感染的预警标志。该研究结果为进一步阐释FcγRIII 在PRRSV感染中发挥的作用奠定了基础。

关键词：FcγRIII；多克隆抗体；夹心ELISA；猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒

Fc受体（Fc receptor，FcR）是广泛表达于免疫细胞的一类重要免疫细胞表面分子，通过特异亲和抗体（Immunoglobulin，Ig）Fc区域，触发和调控机体多种免疫学效应，包括吞噬功能、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、一些细胞因子和炎症介质的分泌等[1]。Fc受体主要有3种类型：FcγRI，FcγRII和FcγRIII。其中FcγRIII是一种低亲和力的IgG Fc受体，FcγRIII会在细胞表面水解，释放出可溶性FcγRIII（sFcγRIII）。据报道，在人的血清中存在着约1.3 μg/mL sFcγRIII，这些大量存在的sFcγRIII主要是由嗜中性粒细胞释放的作用[3]。血清中sFcγRIII水平可作为一些疾病的检测标志，在疾病的防控中发挥着重要作用。例如，多发性骨髓瘤病人血清中sFcγRIII的水平大大下降，并且减少的程度与发病的阶段有关[4]，风湿性关节炎病人血清中sFcγRIII水平比正常水平高很多[5]，艾滋病病人血清中sFcγRIII水平远低于正常水平[6]。目前尚无猪的sFcγRIII的ELISA检测方法的报道，为了探究猪在感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）后血清中sFcγRIII水平变化，本研究利用制备的猪FcγRIII多克隆抗体，建立了双抗体夹心ELISA法，来检测猪的sFcγRIII水平。

1　材料与方法

1.1载体、质粒、细胞、毒株与实验动物pET-30a原核表达载体为本实验室保存载体；猪的全长真核表达质粒pcDNA3.1/FcγRIII为本实验室保存质粒；3只新西兰雌性白兔，购自哈尔滨医科大学实验动物中心。

1.2主要试剂蛋白纯化试剂盒，购自Novagen公司；BCA Protein Assay Kit，购自GenStar公司；FcγRIII单克隆抗体G7，购自AbD公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自中衫金桥生物技术有限公司；TMB显色液，购自Sigma公司；限制性内切酶EcoR I、Xho I，购自TaKaRa公司。

1.3FcγRIII原核表达质粒的构建从全长真核表达质粒pcDNA3.1/FcγRIII中，利用表1中引物F、R，PCR扩增FcγRIII胞外域，PCR产物纯化回收后进行EcoR I和Xho I双酶切，克隆到同样经EcoR I和Xho I双酶切、回收处理的原核表达载体pET-30a中，构建原核表达质粒pET-30a/FcγRIII。EcoR I和Xho I双酶切鉴定阳性的重组质粒由上海华大基因科技服务有限公司测序验证。

表1　PCR引物

1.4重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化将序列分析阳性的重组质粒pET-30a/FcγRIII转化Rosetta感受态细胞，涂板后过夜培养。挑取单个菌落接种于Kan+的LB液体培养基中，37℃振荡培养12 h，以1∶100菌液比例转接入锥形瓶中，待OD600值达到0.4～0.6时，加入IPTG（1 mmol/L）进行诱导，从0 h开始，每隔1 h收集菌液，直到7 h。将收集的菌液离心并进行超声破碎，上清和沉淀分别在SDS-PAGE电泳下检测。选取目的蛋白表达量最高的时间点，进行大量培养及蛋白纯化，蛋白纯化采用Novagen的His.Band蛋白纯化试剂盒，按照试剂盒的说明书进行纯化，BCA试剂盒测定纯化FcγRIII蛋白的浓度。

1.5多克隆抗体的制备将上述纯化的FcγRIII蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合充分乳化，免疫家兔，每只家兔的剂量1 mg/次。初次免疫进行多点皮内注射，之后为皮下注射。2周后以等体积弗氏不完全佐剂与纯化的FcγRIII蛋白充分乳化进行第2，3，4次加强免疫。免疫4次后心脏采血，分离血清。

1.6夹心ELISA方法的建立与应用将制备的多克隆抗体作为捕获抗体，进行系列稀释包被酶标板，确定最适浓度包被酶标板，100 μL/孔，37℃孵育2 h，PBST洗5次。用2%胎牛血清白蛋白（BSA）300 μL/孔，室温封闭2 h，PBST洗5次。纯化的FcγRIII蛋白作为标准抗原，室温孵育2 h，PBST洗5次。FcγRIII单克隆抗体G7作为示踪抗体，确定最佳浓度，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗5次。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为检测系统，确定最适浓度，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗5次。TMB显色，100 μL/孔，室温5～10 min，以2 mol/L H2SO450 μL/孔终止显色反应。在酶标仪上于波长450 nm测定吸光度值。利用建立的ELISA方法检测猪感染PRRSV后，血清中sFcγRIII水平。

图1　pET-30a/FcγRIII质粒的构建

2　结果

2.1原核表达质粒的构建及鉴定从质粒pcD⁃NA3.1/FcγRIII中，利用引物F、R，进行PCR，PCR产物进行琼脂糖电泳，结果如图1a所示，扩增产物约570 bp，与预期大小相符。重组质粒经EcoR I和Xho I双酶切后获得约5 422 bp与570 bp的两条片段，与预期长度相符，命名为pET-30a/FcγRIII（图1b），且重组质粒测序结果表明目的基因被正确无误地克隆至原核表达载体，可用于下游工作。

2.2重组蛋白的诱导表达及纯化将重组表达质粒pET-30a/FcγRIII转化到感受态Rosetta中，经IPTG（1 mmol/L）诱导表达后，进行SDS-PAGE分析。结果显示目的蛋白CD16高效表达，大小约为25 kDa，与预期结果相符，且主要存在于包涵体中（图2a）。利用Novagen的His.Bind蛋白纯化试剂盒，对融合蛋白FcγRIII进行纯化，取少量纯化后的蛋白表达产物进行SDS-PAGE验证蛋白纯化效果，结果显示，纯化的蛋白FcγRIII纯度较好，浓度较高（图2b）。

2.3夹心ELISA方法的建立与初步应用确定FcγRIII多克隆抗体最适包被浓度为1∶1 000，FcγRIII单克隆抗体最适浓度为1∶2 500，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG最适浓度为1∶10 000。BCA法测定的纯化的蛋白浓度为1 mg/mL，将纯化的蛋白进行倍比稀释，确定最适稀释度为从31.25 ng/mL进行2倍的倍比稀释，直到0.06 ng/mL。标准曲线形成良好，R值为0.999（图3a）。利用建立的夹心ELISA方法检测12份PRRSV阳性与阴性血清，结果显示，猪感染PRRSV后，血清中sFcγRIII的水平明显高于阴性猪（图3b）。

图2　重组蛋白的表达与纯化

图3　a标准曲线

图3　b ELISA检测猪血清中sFcγRIII水平

3　讨论

在HIV的研究中发现HIV病人血清中sFcγRIII水平远低于正常人，而sFcγRIII能抑制HIV病毒的复制，在控制HIV的传播中发挥着重要作用[7]。PRRSV感染猪体后，感染猪的多形核白细胞（PMN）细胞表面FcγRIII水平下降，PMN的吞噬能力下降[8]。可见FcγRIII在一些疾病的发生中发挥着重要作用，FcγRIII可在细胞表面发生水解，在上清中产生sFcγRIII，检测sFcγRIII的水平就尤为重要。目前常用的检测sFcγRIII的水平方法是将上清浓缩后进行Western-Blot[9]和ELI⁃SA[7]的方法，但前者敏感性比较低，低水平的sFcγRIII难以检测到，而ELISA方法具有特异性强、灵敏度高及检测速度快等优点，但目前尚无猪的sFcγRIII的ELISA检测方法的报道。本研究利用制备的FcγRIII的多克隆抗体作为捕获抗体，FcγRIII单克隆抗体又作为示踪抗体，建立了ELISA方法。利用建立的猪的sFcγRIII的双抗体夹心ELISA方法检测感染PRRSV的猪体内血清中sFcγRIII水平，结果显示，感染PRRSV的猪体内血清中sFcγRIII水平明显高于对照组，因此推测在PRRSV的感染中，猪体内sFcγRIII水平可起到预警的作用，为PRRSV的防控提供新的思路。

参考文献：

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Development a doubleantibody sandwich ELISA to detect porcine FcγRIII and primary application in pigs infected with PRRSV

GU Wei-hong，GUO Long-jun，NIU Jun-wei，TIAN Zhi-jun，FENG Li，WANG Yu-e （State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China）

Abstract：A double antibody sandwich ELISA was developed using rabbit anti-FcγRIII polyclonal antibody as the capture an⁃tibody，mouse anti-FcγRIII monoclonal antibody as the trace antibody and HRP-conjugated goat anti-mouse IgG as the detection system.The sandwich ELISA was used to detect porcine FcγRIII levels in serum from pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）.Our the results revealed that sFcγRIII levels in serum were significantly increased in pigs in⁃fected with PRRSV，suggesting that sFcγRIII may be referred as early warning of PRRSV infection.These results have laid a foun⁃dation for futher study on interpretation of FcγRIII in PRRSV infection.

Key words：FcγRIII；polyclonal antibody；sandwich ELISA；porcine reproductive and respiratory syndrome virus

中图分类号：S858.28

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0003-03

收稿日期：2015-04-29

基金项目：国家自然科学基金（31372416）

作者简介：谷伟红（1988-），女，硕士生，主要从事动物疫苗与分子免疫学研究，E-mail：weihgu@163.com

通讯作者：王玉娥，E-mail：wangyue@caas.cn

Corresponding author：WANG Yu-e