茶多酚对铬胁迫玉米幼苗的修复作用

王 赫，黄 辉

(1. 天津市南开中学 天津300090；2. 天津师范大学生命科学学院 天津300387)

茶多酚对铬胁迫玉米幼苗的修复作用

王 赫1，黄 辉2

(1. 天津市南开中学 天津300090；2. 天津师范大学生命科学学院 天津300387)

环境污染对人类的危害已成为全球焦点问题之一，而重金属污染则由于其危害严重、作用时间长更引起人们的关注。以铬污染为例，探讨了茶多酚在抵消受重金属胁迫的玉米幼苗生长所产生的影响方面存在的潜在价值。采用水培方法，使玉米种子从萌发长至二叶期时受铬离子胁迫(0、10-5、10-4,mM 重铬酸钾)，再将 3个浓度下生长的二叶期幼苗用水冲去培养液(即去掉重金属作用)，每个浓度的幼苗重新分为两组。对照组用清水继续培养，实验组用0.05%茶多酚水溶液继续培养。25,d后测定各项指标。在一定浓度下，茶多酚会通过升高SOD和POD活性来抵御铬胁迫，而铬浓度超过一定阈值时茶多酚则失去该功能，因此在10-5,mM铬胁迫的根部和10-4,mM铬胁迫的茎叶，其SOD和POD活性出现升高情况。铬胁迫时以及茶多酚修复时，玉米的POD、SOD同工酶表达均发生明显变化。利用伊文思蓝(evans blue)作为细胞活性染料, 检测了胁迫处理后以及茶多酚修复后的细胞活性。结果显示,不同浓度铬的胁迫均造成了根和叶片细胞一定程度的伤害，而显微成像也充分证实茶多酚修复作用的有效性。

玉米 铬胁迫 茶多酚 同工酶

随着工农业生产的发展，三废排放，矿产开发和 利用，污水灌溉以及农药、除草剂和化肥的使用等严重污染了土壤、水质和大气，导致环境恶化。各种工业(如冶炼、电镀、采矿等)废水和固体废弃物的渗出液直接排入水体，致使水体中重金属含量越来越高。铬被称为重金属“五毒”之一，过量铬可以直接或通过食物链危害人类健康，存在着严重的致癌、致畸作用。[1]

铬通过运输必需元素(Fe、S、P)的载体以主动运输形式被植物根部吸收并储存于细胞液泡中，限制了其进一步迁移。[2]当环境中的重金属数量超过某一临界值时就会对植物产生一定的毒害作用。重金属穿过植物细胞膜时，会胁迫植物产生过多自由基而导致氧化胁迫。引起蛋白质和核酸等生物大分子变性以及膜脂过氧化，从而对植物产生伤害。植物体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是植物适应多种逆境胁迫的重要酶类，在清除自由基的过程中发挥着重要的作用，保护细胞免受伤害。[3]茶多酚可以通过诱导细胞内这些酶的活性而维持抗氧化系统的较高活性或含量，从而有效减少活性氧对叶绿素分子的过氧化损伤，促进蛋白质合成或抑制其分解，缓解铬对植物的污染胁迫，提高植物对铬的耐受性，从而增强适应重金属逆境的能力。玉米属C4植物，生长迅速，生物量大，对多种环境因子的胁迫均表现出较强的抗性，是广泛用于重金属污染研究的重要农作物。[4]本实验以玉米为实验材料，以铬污染为例，探讨了茶多酚在抵消受重金属胁迫的玉米幼苗生长所产生的影响方面存在的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 植物培养及处理

在30 cm白瓷盘铺上3层纱布，将玉米均匀播撒其上，共3盘，每盘100粒。将含0、10-5、10-4,mM 重铬酸钾加入1/2 Hoagland营养液中，每天浇灌1次，使其保持湿润状态，同时也保持重铬酸钾浓度恒定。处理 6,d后将出芽的种子移盆水培，15 d后测定各项指标。此时玉米幼苗已长至二叶期。用水冲去 3种浓度下生长的二叶期幼苗的培养液(即去掉重金属作用)，每个浓度的幼苗重新分为两组(每组设多个平行)。对照组用清水继续培养，实验组用0.05%茶多酚水溶液继续培养。25 d后测定各项指标。

1.2 形态指标测定

测定前从盆中取出玉米幼苗，用蒸馏水清洗，表面残留的水分用滤纸吸干，测定总鲜重。从根茎结合部将其分开，再分别测定其鲜重。每个处理随机选取10株幼苗平展，用直尺测量其根长以及茎、叶长。

1.3 生理生化指标测定

将已称好的样本剪碎，放入研钵中，根据鲜重加入一定体积的100 mM 磷酸缓冲液(PBS)，pH=8.0，研磨成浆。实验中 10-5、10-4,mM 重铬酸钾处理的茎叶用10 mL PBS提取，其他样本用5 mL PBS提取。倒入离心管中，在3 500 r/min转速下，离心15 min，分离上清液备用。

可溶性蛋白含量的测定采用考玛斯亮蓝染色法。SOD酶活的测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法。POD酶活的测定采用愈创木酚法。CAT酶活和抗坏血酸过氧化酶(APX)的测定采用紫外比色法。[5-6]

同工酶广泛存在于生物界中，是功能相同但结构不同的一组酶，它们主要由等位基因或不同基因位点编码。由于其结构中氨基酸序列或组成有差异，所以同工酶的电泳迁移率存在差异。同工酶的电泳图谱可以从分子水平上反映出细胞所表现的明显的种属组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志。[7]

1.4 细胞活性的测定

采用伊文思蓝染色法。其原理在于伊文思蓝能够与蛋白结合形成伊文思蓝蛋白复合物。正常细胞膜不能透过伊文思蓝，而当细胞受到损伤后，伊文思蓝进入细胞并与蛋白结合，将其染成蓝色。[8-9]

1.5 统计分析方法及作图

采用 SPSS version 18.0 统计软件进行统计分析，作图使用Microsoft Excel、PowerPoint。

2 结果与分析

2.1 生长状况

如图1所示，不同铬浓度处理时，鲜重、根长、苗长均低于对照，再经 0.05%的茶多酚处理后，鲜重、根长、苗长均高于对照。说明在一定铬浓度范围内胁迫的玉米幼苗，经 0.05%的茶多酚处理后其鲜重及生长指标有明显改善。茶多酚有拮抗重金属胁迫的作用。根据 SPSS分析表明，与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根的作用(只在0和10-5,mM铬浓度胁迫下)有显著差异(p<0.05)，对有无铬胁迫的苗的作用均有显著差异(p<0.05)。

图1 不同铬浓度对玉米鲜重的影响Fig.1 Effect of various chromium stresses on the average fresh weight of maize

2.2 生理生化指标

2.2.1 可溶性蛋白含量

如图2所示，根中的可溶性蛋白含量在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经 0.05%的茶多酚处理后均高于对照组。但叶中的可溶性蛋白含量在不同铬浓度胁迫下持续升高，再经 0.05%的茶多酚处理后均高于对照组。根据 SPSS分析表明，与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根的作用有显著差异(p<0.05)，对有无铬胁迫的叶的作用均有显著差异(p<0.05)。

图2 不同铬浓度对可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effect of various chromium stresses on concentrations of soluble protein

2.2.2 SOD酶的活性

如图3所示，根中的SOD酶活性在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经 0.05%的茶多酚处理后，10-5,mM 明显高于对照组。但叶中的 SOD酶活性在不同铬浓度胁迫下持续升高，再经 0.05%的茶多酚处理后10-4,mM明显高于对照组。根据SPSS分析表明与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根和叶的作用均有显著差异(p<0.05)。

图3 不同铬浓度对SOD酶活的影响Fig.3 Effect of various chromium stresses on the activity of SOD

2.2.3 POD酶的活性

如图4所示，根中的POD酶活性在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经 0.05%的茶多酚处理后，只有10-5,mM 高于对照组，但整体均低于处理前。叶中的POD酶活性在不同铬浓度胁迫下为下降趋势，再经0.05%的茶多酚处理后，只有 10-4,mM 高于对照组，但整体均低于处理前。根据 SPSS分析表明与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根和苗的作用均有显著差异(p<0.05)。

图4 不同铬浓度处理的样品POD酶活的比较Fig.4 Effect of various chromium stresses on the activity of POD

2.2.4 CAT酶的活性

如图5所示，根中的CAT酶活性在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经 0.05%的茶多酚处理后，先降后升，只有10-5,mM明显低于对照组。叶中的CAT酶活性在不同铬浓度胁迫下为先降后升趋势，再经0.05%的茶多酚处理后，先升后降。只有 10-5,mM 明显高于对照组。根据 SPSS分析表明，与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根和叶的作用(只在10-5,mM铬浓度胁迫下)有显著差异(p<0.05)。

图5 不同铬浓度对CAT酶活的影响Fig.5 Effect of various chromium stresses on the activity of CAT

2.2.5 APX酶的活性

如图6所示，根中的APX酶活性在不同铬浓度胁迫后再经 0.05%的茶多酚处理，先升后降，加茶多酚的实验组均明显低于对照组。叶中的 APX酶活性在不同铬浓度胁迫再经 0.05%的茶多酚处理后为先降后升趋势，加茶多酚的实验组均明显高于对照组。根据 SPSS分析表明，与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的作用均有显著差异(p<0.05)，但对根的作用(只在10-4,mM铬浓度胁迫下)有显著差异(p<0.05)。

图6 不同铬浓度对APX酶活的影响Fig.6 Effect of various chromium stresses on the activity of APX

2.2.6 SOD同工酶的电泳图谱(见图7)

比较玉米根和叶中的 SOD同工酶的谱带，条带数量不同，说明 SOD同工酶在不同器官中表达不同。在根中，前期铬处理后，箭头标注的条带10-5,mM处最亮；后期经茶多酚对比处理后，箭头标注的条带10-4,mM 处最亮。在叶中，前期铬处理后以及后期经茶多酚对比处理后，箭头标注的条带亮度随浓度升高而逐渐变亮。圆圈所示部位有新的条带出现。图谱显示结果与SOD酶活性测定结果一致。

图7 SOD同工酶谱及示意图Fig.7 The zymogram and schematic diagram of SOD

2.2.7 POD同工酶的电泳图谱(见图8)

比较玉米根和叶中的 POD同工酶的谱带，条带数量不同，说明 POD同工酶在不同的器官中表达不同。在根中，前期铬处理后，箭头标注的条带颜色随浓度的升高而逐渐变浅；而后期经茶多酚对比处理后，情况正好相反，箭头标注的条带颜色随浓度的升高而逐渐加深。圆圈所示部位有新的条带出现。

在叶中，前期铬处理后，箭头标注的条带颜色随浓度升高A条带逐渐变浅，B条带逐渐加深；后期经茶多酚对比处理后，箭头标注的条带的颜色均随浓度的升高而逐渐加深。圆圈所示部位有新的条带出现。图谱显示结果与POD酶活性测定结果一致。

图8 POD同工酶谱及示意图Fig.8 The zymogram and schematic diagram of POD

2.3 细胞活性指标

2.3.1 玉米根的显微图像(见图9)

前期铬处理的玉米根部结构在 10-4,mM 浓度下已明显出现破损。而后期经茶多酚处理后，损坏程度明显减小，可见茶多酚的修复效果。

图9 不同胁迫处理下玉米根的照片及细胞活性Fig.9 Pictures and cell viability in root of maize under different stresses

2.3.2 玉米叶片在不同胁迫条件下的伊文思蓝染色情况

图10 不同胁迫处理下玉米叶片的伊文思蓝染色照片及细胞活性Fig.10 Evans blue dyeing pictures and cell viability in leaves of maize under different stresses

从图 10中可以看到，前期叶片经不同铬浓度胁迫处理后，蓝色染色区域随着处理梯度增加而增大，染色深度也有一定程度的增加，尤其是输导组织部位染色程度最深。然而后期经茶多酚处理后，蓝色染色区域明显缩小，染色深度也变浅，可见茶多酚的修复效果。

3 结 论

茶多酚是茶叶中的多酚类物质，来源广泛且价格便宜。它没有任何毒性，对人体有很多益处。例如，它是一种强抗氧化剂，可清除人体内的自由基；还可以防止辐射损伤，已被应用于减轻放疗的不良反应。同时，由于茶多酚具有多个酚羟基，与金属有很强的配位络合作用，使其形成沉淀从而消除重金属污染。在一定浓度下，它还可以促进植物抵抗重金属污染的能力。由于这些特点，使茶多酚具备了可快速恢复土壤的农业价值的特点，且该法价格便宜，具有一定的可行性。

植物体内抗氧化酶可以清除活性氧，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)作为植物体内抗氧化酶系统的重要组成部分，在清除自由基方面发挥了重要作用。SOD、POD、CAT三者协调一致，共同完成活性氧类的清除。除了抗氧化酶系统之外，植物体内还存在膜保护物质，其中抗坏血酸是一种重要的膜保护物质，抗坏血酸能清除多种活性氧，抑制不饱和脂肪酸氧化，防止降解，对稳定膜结构十分重要。因此，在重金属胁迫条件下，植物体通过SOD、POD、CAT及其他抗氧化物质清除活性氧自由基，保护细胞膜结构。

在没有铬胁迫的情况下，加入茶多酚会降低蛋白浓度以及抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的活性；而在10-5,mM 铬胁迫下，茶多酚会使根和叶的蛋白浓度升高，同时对根部 SOD活性有明显提升作用，未导致POD活性明显变化，而 SOD是抗氧化第一道防线，其活性升高可明显抵御铬胁迫造成的氧化损伤，茎叶部分除 CAT活性升高外，其余与未加铬时茶多酚对酶活性的影响一样，其原因可能是大量铬积累于根部，茎叶部分受的影响较小导致；在 10-4mM 铬胁迫下，根部SOD与POD活性加茶多酚也呈下降趋势，CAT活性不变，而茎叶部分SOD与POD活性呈上升趋势，CAT活性也保持不变，其原因可能为：在一定浓度下，茶多酚会通过升高SOD和POD活性来抵御铬胁迫，而铬浓度超过一定阈值茶多酚失去该功能，因此在10-5mM铬胁迫的根部和10-4mM铬胁迫的茎叶部分，SOD和POD活性出现升高情况。

研究还发现，SOD同工酶以及POD同工酶的电泳图谱显示结果与SOD酶以及POD酶活性测定结果相一致。另外从玉米根的显微成像以及玉米叶片在不同胁迫条件下的伊文思蓝染色情况来看，也很好地佐证了这一点。重度铬胁迫可造成根变软以至于部分溃烂，推测细胞壁骨架和膜结构受到严重的伤害。[10]正常叶片具有很低的伊文思蓝染色水平，受到不同浓度铬胁迫后，玉米幼苗的全叶片染色水平均逐步上升，显示了较好的重复性。重金属胁迫后再经茶多酚处理，染色水平均明显降低，证明茶多酚的修复效果明显。■

［1］ 徐衍忠，秦绪娜，刘祥红.铬污染及其生态效应[J].环境科学与技术，2002(25)：8-10.

［2］ Cervantes C，Garcia J C，Devars S，et al. Interactions of chromium with micro-organisms and plants[J]. FEMS Microbiol Rev，2001(25)： 335-347.

［3］ 姚慧，蔡庆生.缓解植物重金属胁迫伤害的途径及其机理[J]. 浙江农业科学，2011(1)：144-147．

［4］ Liu D H，Wang M，Zou J H，et al. Uptake and accumulation of cadmium and some nutrient ions by roots and shoots of maize(Zea mays L.)[J]. Pak J Bot，2006，38(3)：701-709.

［5］ Anderson J V，Chevone J V，Hess J L. Seasonal variation in the antioxidant system of eastern white pine needles：Evidence for thermal dependence[J]. Plant Physio，1992(98)：501-508.

［6］ Lu Q T，Wen X G，Liu C M，et al. Photoinhibition and photoprotection in senescent leaves of field-grown wheat plants[J]. Plant Physiol Biochem，2003(41)：749-754.

［7］ 孙海燕，王利沙.八种大白菜过氧化物酶同工酶分析[J]. 现代农业科技，2009(5)：8-9.

［8］ Castro-Concha L A，Escobedo R M，Miranda-Ham M L. Measurement of cell viability in vitro cultures[J]. Methods Mol Biol.，2006(318)：71-76.

［9］ Ibla J C，Khoury J. Methods to assess tissue permeability[J]. Methods Mol. Biol，2006(341)：111-117.

［10］ 刘楠，林植芳. 用伊文思蓝染色法检测植物整体叶片的细胞活性[J]. 植物生理学报，2011，47(6)：570-574.

Effectiveness of Tea Polyphenols Repair on Chromium Stress on Maize Seedlings

WANG He1，HUANG Hui2
(1．Tianjin Nankai High School，Tianjin 300090，China；2．College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China)

The harm of the environmental pollution to human beings has become one of the world’s most concerned problems. Heavy metal pollution, for instance, has aroused extensive concerns due to their severity and long term harmness. In this paper, the potential value of tea polyphenols in offsetting the heavy metal stress on the growth of maize seedlings was studied by taking chromium pollution as an example. In order to get rid of the interference of other factors in the soil, maize seeds were cultivated in a liquid medium, which contains different concentrations of K2Cr2O7(0、10-5、10-4,mM). When the seeds grew into their three-leaf period, the seedlings were rinsed with clean water to get rid of the heavy metal. Seedlings of each concentration were divided into two groups. The control groups still cultivated seedlings in clean water while the experimental groups kept them in a 0.05% tea polyphenols aqueous solution. After 25 days, physiological parameters of seedlings were measured. At a certain concentration, tea polyphenols could resist chromium stress by increasing SOD activities and POD activities. However, when the chromium concentration exceeded a certain threshold, tea polyphenols lost its function. So the activities of SOD and POD in root and leave increased under the stress of 10-5,mM chromium. Under the chromium stress and tea polyphenols repair, the expression of POD’s isozymes and SOD’s isozymes significantly changed. The current study tested stress induced cell viability of intact leaves of stress treatment and tea polyphenols repair by evans blue method. The results showed that different types of stresses caused leaf and root cell damages to different degrees and microscopic images fully demonstrated the effectiveness of tea polyphenols repair.

maize；chromium stress；tea polyphenols；isozymes

Q945.78

A

1006-8945(2016)02-0043-06

2016-01-11