戊型肝炎病毒长爪沙鼠感染模型的初步研究

朱光泽屈勇刚李一权兰添范园园胡宁宁张诺娜李霄金宁一

（1.长春中药大学附属医院检验科，长春 130021；2.军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130122；3.石河子大学动物科技学院，石河子 832003）

戊型肝炎病毒长爪沙鼠感染模型的初步研究

朱光泽1，2屈勇刚2，3李一权2兰添2范园园2胡宁宁2张诺娜2李霄2金宁一2

（1.长春中药大学附属医院检验科，长春 130021；2.军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130122；3.石河子大学动物科技学院，石河子 832003）

旨在探索应用长爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）构建戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）动物模型的可行性，从猪粪便稀释悬液中提取HEV RNA并鉴定，经腹腔和口服接种HEV于长爪沙鼠，并每周采集血液、相关器官（心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、脾脏）及粪便。用反转录PCR（RT-PCR）和免疫组化等检测方法分析各个样品。结果表明，感染后第7天开始，可从血液、肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏、肺、粪便中检测到HEV RNA；通过免疫组化和组织病理学观察，发现HEV可在肝脏中进行表达，并且能引起肝组织病理变化，但感染HEV后长爪沙鼠均缺乏较明显的临床表现症状。结果提示，长爪沙鼠对 HEV具有易感性，感染后肝脏出现小叶性肝炎的病理变化，具有作为HEV感染动物模型的潜在价值。

戊型肝炎病毒；长爪沙鼠；动物模型

病毒性肝炎是一个全球性的健康问题，尤其是戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的戊型肝炎［1，2］。戊型肝炎病毒为单链RNA，无包膜病毒，属于肝炎病毒科肝炎病毒属［3-6］。以往的研究提出了4种HEV的传播途径，分别为粪-口传播、食源性传播、输血和母婴垂直传播［7］。感染戊型肝炎病毒可导致体内长期的凝血和胆汁淤滞，并且还会提高孕妇的死亡率［8-10］。近年来研究还表明，戊型肝炎病毒感染除了提高孕妇的死亡率之外，还会导致男性和非妊娠妇女的死亡［11］。 在孕妇中产生高死亡率的原因尚不明确，也没有具体的治疗方法，同时，HEV促进疾病进展的细胞蛋白质和途径仍不明确。这些都归根于HEV难以分离及纯化、同时缺乏稳定的HEV细胞感染培养系统，阻碍了对HEV生物学的理解。

1983年首次用戊肝患者的粪便提取物成功感染了2只猕猴，成为了戊型肝炎动物实验的先例［12］。此后国内外学者陆续发现有10多种灵长类动物品系和猪对HEV易感，适宜于做动物模型。但灵长类动物具有昂贵、来源有限、实验条件要求高等缺点。随后，研究人员发现野鼠可自然感染HEV，但选用野鼠作为动物模型也具有一定的风险，并且其来源也相对有限。

长爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）亦称蒙古沙鼠，是一种具有广阔开发前景的多功能性啮齿类实验动物，并且在医学研究领域里作为实验动物已有20-30年的历史。其某些特有的生理学、解剖学和行为学特征对于多种疾病的研究具有重要价值，如脑血管疾病、营养代谢病和自发性肿瘤等［13］。长爪沙鼠不仅对多数病原易感，而且在 某些病原感染下，会表现出与人类相似的病理特征和临床症状。因此，长爪沙鼠作为一种“多能”性实验动物，具有非常重要的开发利用价值。

本研究拟用猪源HEV病毒感染长爪沙鼠，通过RT-PCR检测，组织病理学观察等方法，探索将长爪沙鼠作为HEV感染模型的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 猪HEV阳性粪便采自长春某猪场，经RT-PCR鉴定为阳性、属基因Ⅳ型，-70℃保存。

将阳性粪便用PBS制成1∶10的悬液，4℃，4 000 r/min离心20 min，取上清，用0.22 μL无菌滤器滤过除菌，测定RT-PCR滴度后备用。

1.1.2 实验动物 40-50日龄的长爪沙鼠获赠于浙江省疾病预防控制中心。

1.1.3 检测试剂盒 双抗原夹心ELISA检测试剂盒购自北京万泰生物药业公司；TRIZOL Reagent购自Invitrogen公司；UltrasensitiveTMS-P超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 长爪沙鼠人工感染实验 选取检测为HEV阴性的健康长爪沙鼠24只。每只沙鼠分别以腹腔接种及口服接种的途径接种方法1.1.1中处理后的HEV阳性材料0.5 mL，并连续观察50 d。分别在7、14、21、28、35和50 d无痛处死2只长爪沙鼠，并采血及分离血清检测HEV抗体和检测HEV RNA，同时采集心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、脾脏、小肠、回肠、直肠检测HEV RNA。

1.2.2 HEV抗体检测 使用北京万泰生物制药公司提供的抗-HEV抗体酶联免疫试剂（双抗原夹心法），按照说明书检测血清中抗-HE V抗体并判断结果。

1.2.3 HEV RNA的RT-PCR检测

1.2.3.1 引物设计 根据GenBank中注册的HEV各基因型的保守区序列，设计一套简并引物，以M1、M2为外引物；M3、M4为内引物。

M1：5'-AAC（T）TATGCA（C）CAGTACCGGGTTG-3'（5 725-5 746 bp）；M2：5'-CCCTTATCCTGCTGAGCATTCTC-3'（6 433-6 455 bp）；M3：5'-GTC（T）ATGC（T）TGCATACATGGCT-3'（6 010-6 031 bp）；M4：5'-AGCCGACGAAATC（T）AATTCTGTC -3'（6 336-6 357 bp）。

1.2.3.2 HEV正链RNA的RT-PCR检测 按照TRIZOL Reagent说明书提取HEV RNA。取RNA 14 μL加1 μL的Oligo（dT），于75℃加热5 min后迅速冰浴10 min，然后加入5×M-MLV buffer 6 μL，dNTP 1.5 μL，RNasin 1 μL，M-MLV 1 μL，双蒸水6.5 μL，混匀后42℃ 1 h，95℃ 5 min，-20℃ 30 min。

取上述合成的cDNA进行两轮PCR。首轮使用的引物为M1和M2，PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min。第二 轮使用的引物为M3和M4，PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 HEV负链RNA的RT-PCR检测 对检测到HEV 正链的RNA的样品，进行HEV负链RNA的RT-PCR检测。

1.2.4 免疫组织化学观察 先将组织制成常规石蜡切片，经脱蜡和脱水后对组织抗原进行相应的修复。加过氧化酶阻断液，室温下孵育10 min。然后在每张切片中先后加入50 μL正常非免疫动物血清、50 μL兔抗p293（ORF2 aa382-674）抗体（1∶1 000）及50 μL生物素标记的二抗，分别在室温下孵育1 h、1 h及10 min。再往切片加入50 μL链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min。最后往切片加入100 μL DAB溶液，作用3 min左右后，冲洗干净，苏木素复染，再冲洗干净；切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固后显微镜下观察。

1.2.5 病理组织学观察 将待观察的病料用10%中性甲醛溶液固定及石蜡包埋后，以3.5 μm 的厚度连续切片，经常规苏木素-伊红染色后显微镜下观察。

2 结果

2.1 粪便悬液的RT-PCR滴度测定

粪便悬液经10递倍稀释后，RT-PCR检测结果见表1。计算结果表明，接种用猪粪便悬液的RTPCR滴度为10-6.78。

表1 接种用猪粪便悬液中HEV RNA 的RT-PCR滴度

2.2 ELISA检测人工感染长爪沙鼠HEV抗体

长爪沙鼠在接种粪便悬液之后 ，在接种后的前2 d内表现出精神不振，但之后的未再出现明显的临床症状。血清抗体最早于感染后的第21天转为阳性，可持续到感染后第50天（表2）。

表2 感染沙鼠HEV抗体的ELISA检测

2.3 人工感染长爪沙鼠的HEV正链RNA RT-PCR检测

感染后第7天可从血液、心、肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏、肺等脏器或粪便中检测到HEV正链RNA，最长的可持续到感染后第50天（图1和表3）。

图1 长爪沙鼠感染21 d后组织样品正链RNA 的RT-PCR检测

表3 长爪沙鼠感染组织样品的正链RNA1 RT-PCR检测

2.4 人工感染长爪沙鼠的HEV负链RNA RT-PCR检测

感染长爪沙鼠的负链RNA RT-n-PCR检测结果见图2和表4。

表4 长爪沙鼠感染组织样品的负链RNART-n-PCR检测

2.5 病理组织学观 察

观察发现大部分脏器组织中缺少典型的病理变化。而肝脏的主要病变为广泛肝细胞变性、空泡变性、浊肿、水样变性而致气球样变，肝细胞胞浆疏松、空泡变性、胞核大小不等，出现双核、肝窦扩张或变窄，病理符合小叶性肝炎（图3）。

图2 长爪沙鼠感染21 d后组织样品的负链RNA RT-PCR检测

2.6 免疫组织化学观察

免疫组织化学观察可见在细胞质中有HEVAg大量分布，细胞核与周围边的细胞界限清晰可见（图4）。

图4 人工感染长爪沙鼠的免疫组织化学照片（100×）

3 讨论

目前，可实验感染HEV的动物主要有非人灵长类动物和猪，其中以非人灵长类动物最为常用［14］。自1983年Balayan等［12］首次使用戊肝患者的粪便提取物成功感染2只猕猴以来，许多非人灵长类动物模型（黑猩猩、恒河猴、枭猴、短尾猴、小绢猴、非洲绿猴等）逐步的建立了起来，其中较为常用的还是猕猴模型。猪作为基因Ⅲ型、Ⅳ型的自然宿主，也可应用于HEV感染的研究。1990年Balayan等［15］首次用1株亚洲人HEV成功感染猪，实现了HEV猪模型的制作。然而以非人灵长类动物或猪作为实验动物模型具有繁殖周期长、饲养管理繁、价格昂贵及来源有限等缺点［16］。

长爪沙鼠因其独特的生物学特性在病毒学领域、细菌学领域及寄生虫学领域中应用广泛。如在病毒学领域方面，广泛应用于肾综合征出血热［17］、流行性出血热病毒［18］和乙型肝炎病毒［19］等研究。说明，其在研究人类疾病及新药开发领域具有重要的价值。

本研究首先将HEV阳性猪粪便稀释悬液接种于长爪沙鼠，并每周采集血清和多种组织（心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、脾脏、小肠、回肠、直肠），随后通过ELISA和RT-PCR、免疫组织化学及病理组织学观察进行了感染后检测。

结果发现长爪沙鼠不仅可感染HEV，并且能产生HEV抗体，并且在血液、心、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠系膜淋巴结、粪便中检测到了HEV RNA。再通过对负链RNA的检测，发现在肝、脾、肺、肠系膜淋巴结中存在HEV负链RNA，进而表明HEV可以在以上组织中进行复制，其中病毒在肝脏中残留时间最久。Kasorn-dorkbua等［20］用HEV阳性样品接种至SPF猪体内，结果发现直接接种在心、胰组织的SPF猪未感染HEV，而直接接种在肝组织的SPF猪成功感染HEV，表明猪体内肝脏是HEV复制的主要器官；Lee等［21］使用原位杂交技术检测机体内不同组织中的HEV RNA，结果发现存在于肝脏部位的HEV RNA杂交信号最强。以上研究结果与本研究结果均说明肝脏是HEV复制的主要器官部位［22］。

在接种后的前2天内长爪沙鼠表现出了精神不振等症状，但之后的未再出现较为明显的临床症状，这与赵素元等［23］使用子午沙鼠作为HEV动物模型的结果相似，说明啮齿类动物模型在具有可大量用于实验，以降低偶然因素带来的影响，增加实验数据的稳定性和可靠性等优势之外，在临床表现方面还存在一些不 足之处。但在HEV免疫组化染色发现，细胞质中有大量戊型肝炎病毒抗原（HEV-Ag）的分布，同时在组织病理学观察发现，除肝脏之外大部分脏器组织中缺少典型的病理变化，肝脏的主要病变为广泛肝细胞变性、空泡变性、浊肿、水样变性而致气球样变，肝细胞胞浆疏松、空泡变性、胞核大小不等，出现双核、肝窦扩张或变窄，病理现象均与小叶性肝炎相符合。有研究表明，在发展中国家大约有一半HEV感染患者表现出急性肝炎的症状［24］，病理学观察可发现肝细胞排列紊乱、汇管区有多形核细胞和淋巴细胞浸润等现象［25］。Ji等［26］用Ⅳ型猪HEV通过静脉注射感染猕猴后，肝组织病理学检查后发现，肝细胞有轻到中度水肿、肝门周围存在淋巴细胞浸润等与人急性肝炎病理学现象相似的病变。说明长爪沙鼠在感染HEV后所显示的病变与人及非灵长类动物具有一定的相似性，这一结果说明长爪沙鼠具备作为HEV动物模型的潜在价值。我们有必要进一步对最佳接种途径、时间、环境及对不同基因型HEV的易感性、系统比较病理学观察等进行研究。长爪沙鼠HEV感染模型的建立，将为今后的HEV研究提供一种更为理想的途径，加速HEV的研究进程。

4 结论

本实验探索了使用长爪沙鼠作为HEV感染模型的可行性。通过实验发现，长爪沙鼠具有可感染HEV及体内复制病毒的能力，同时还发现其组织病理学特征与人类具有相似性，说明其具有作为HEV动物模型的潜在价值。

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（责任编辑 马鑫）

A Preliminary Study on Infection Model of Mongolian Gerbil by Hepatitis E Virus

ZHU Guang-ze1，2QU Yong-gang2，3LI Yi-quan2LAN Tian2FAN Yuan-yuan2HU Ning-ning2ZHANG Nuo-na2LI Xiao2JIN Ning-yi2
（1. The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021；2. Institute of Veterinary Science，The Academy of Military Medical Sciences，Changchun 130122；3. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003）

To explore the feasibility of using Mongolian gerbils（Meiiones unguiculataus）to construct an animal model of hepatitis E virus（HEV），HEV RNA was extracted from the diluted suspension of swine feces，then Mongolian gerbils were experimentally inoculated with the HEV via intraperitoneal and oral. Subsequently，the samples of blood，relevant organs（heart，liver，spleen，lungs，kidneys，mesenteric lymph nodes，and spleen）and feces were collected weekly. Samples were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. As a result，from day 7 after infection，HEV RNA was detected from the blood，kidney，spleen，mesenteric lymph nodes，liver，lung and feces. The analysis of immunohistochemistry discovered that HEV was expressed in the liver，and caused the pathological changes in liver tissue，but it was lack of obvious clinical manifestations in Mongolian gerbils after HEV infection. All above results suggest that Mongolian gerbils have susceptibility to HEV，and have pathological changes of lobular hepatitis in the liver after HEV infection，indicating that Mongolian gerbils have a potential value to be the animal model of HEV infection.

hepatitis E virus；Mongolian gerbils；animal model

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.032

2015-07-20

朱光泽，男，博士，教授，研究方向：分子病毒学；E-mail：zhuguangze820@126.com

金宁一，男，研究员，博士生导师，研究方向：分子病毒学；E-mail：ningyiK@126.com