基因枪转化法对抗旱基因导入玉米的研究

李志亮吴忠义杨清张希太叶嘉邢浩春陈建中黄丛林

（1.邯郸学院 生命科学与工程学院，邯郸 056005；2.北京农业生物技术研究中心，北京 100097；3.南京农业大学生命科学学院，南京210095；4.河北省邯郸市农业科学院，邯郸 056001；5.河北省高校冀南太行山区野生资源植物应用技术研发中心，邯郸 056005）

基因枪转化法对抗旱基因导入玉米的研究

李志亮1，2，5吴忠义2杨清3张希太4叶嘉1，5邢浩春1，5陈建中1，5黄丛林2

（1.邯郸学院 生命科学与工程学院，邯郸 056005；2.北京农业生物技术研究中心，北京 100097；3.南京农业大学生命科学学院，南京210095；4.河北省邯郸市农业科学院，邯郸 056001；5.河北省高校冀南太行山区野生资源植物应用技术研发中心，邯郸 056005）

全球水资源短缺，干旱已是玉米生产发展的主要限制因素。通过培育抗旱能力提高的转P5CS基因玉米株系，为玉米抗旱遗传育种提供新材料。利用基因工程策略构建植物表达载体pBPC-P5CS-F129A，用基因枪法对玉米自交系京501幼胚愈伤组织进行遗传转化，在选择培养基中加入10 mg/L 的草丁膦进行筛选，对草丁膦抗性再生植株进行了PCR 检测和 Northern blot鉴定，对转P5CS基因玉米植株进行了抗旱性分析。结果表明，与对照相比，转基因植株的抗旱能力得到提高。干旱胁迫下，转P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比对照高，而丙二醛含量比对照低。

玉米；愈伤组织；基因枪法；草丁膦；遗传转化；抗旱性

水分缺乏是世界范围内限制作物产量的一个主要因素，提高农作物产量需要培育耐旱种质［1］。为了减轻干旱对农业生产造成的损失，人们一方面采用改良土壤、合理灌溉等农业措施；另一方面通过培育作物抗旱品种来提高作物的抗旱能力。植物体内存在许多与干旱相关的信号转导通路，植物通过激活许多信号通路响应干旱胁迫，使植物抵御或适应胁迫［2］。

干旱胁迫诱导所表达的基因主要包括起单一功能作用的基因和调控基因。第一类单一功能作用的基因主要是指编码产物可在逆境下直接起保护作用的相关基因。（1）抗氧化基因。编码产物如超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶。（2）合成渗透调节物质的基因。该类基因的过表达增加了细胞渗透保护物质，如脯氨酸、甜菜碱、海藻糖、果聚糖的合成能力，使其在细胞中积累，以维持细胞较高的渗透压，从而增强植株的抗旱性。（3）其他胁迫相关基因，其编码产物参与保护生物大分子及膜结构。第二类是具有调控功能的基因，主要是参与信号转导或转录调控相关的基因，其编码产物可在逆境胁迫下起调节作用。如转录因子和参与植物细胞信号转导的基因［3］。

目前，用于玉米的抗旱基因工程育种也主要是这两类基因。在抗旱功能基因转化玉米方面，主要有甜菜碱合成酶基因betA［4］，蛋白激酶基因NPK1［5］，玉米磷脂酶C基因（ZmPLC1）［6］，小盐芥（Thellungiella halophila）液泡H+焦磷酸酶（vacuolar H+-pyrophosphatase，TsVP）［7］，AtGPX3基因［8］，隣脂酰肌醇合成酶ZmPIS基因［9］，枯草杆菌cspB基因［3］，编码胆碱脱氢酶的BADH 基因［10］。

高等植物中，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是由谷氨酸生物合成脯氨酸的限速酶。在干旱胁迫下许多植物体会积累大量的脯氨酸，脯氨酸在细胞内可作为渗透调节剂降低细胞质的水势，维持胞质的水分状况，使植物适应干旱胁迫［11，12］。脯氨酸累积与植物对干旱和盐胁迫的适应性呈正相关性关系［7］。脯氨酸的生物合成途径首先在大肠杆菌中被发现［13］。在植物体内，脯氨酸的合成是通过谷氨酸途径和鸟氨酸途径进行的，其中谷氨酸途径在渗透胁迫条件下占主要地位［14］。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）由P5CS基因编码。在高等植物中，第一个P5CS基因是从豇豆（Vigna aconitifolia）中克隆的［15］。基因表达分析表明，P5CS 基因能够在豇豆叶片中高水平表达，且在根中的表达受盐胁迫诱导，暗示其在脯氨酸生物合成中发挥重要作用，在植物中表达可引起渗透调节［15］。研究证明，转P5CS基因的高羊茅［16］和白三叶［17］的抗旱性有一定程度的增强。

1987年，Klein等［18］利用基因枪转化洋葱（Allium cepa）表皮细胞获得成功，使这一技术在单子叶植物的遗传转化中得到应用。而利用基因枪法对玉米开展基于P5CS基因的遗传转化还未见报道。本研究利用基因枪法将豇豆P5CS基因的突变型P5CS-F129A基因导入玉米自交系京501中，经草丁膦筛选获得转化体，对草丁膦抗性植株进行PCR检测和Northern blot鉴定，同时，对转基因植株进行脯氨酸和丙二醛（MDA）含量的测定。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的玉米（Zea mays L.）为自交系京501，由北京市农林科学院玉米中心提供。

1.2 方法

1.2.1 植物表达载体 质粒pBPC-P5CS-F129A由北京农业生物技术研究中心提供，该基因上游为Ubi（玉米泛醌素）启动子，下游为 nos终止子，选择标记基因是bar基因（图1）。

图1 pBPC-P5CS-F129A质粒图谱

1.2.2 玉米幼胚的接种 取授粉后 10-13 d、幼胚大小为 1-2 mm的玉米果穗，去苞叶后在70%的酒精中浸泡5-10 min，取出后用解剖刀削去种皮及部分胚乳，挑出幼胚，接种于诱导培养基上。

1.2.3 培养基 基本培养基：N6大量、B5微量、N6有机、Fe盐、脯氨酸690 mg/L、水解酪蛋白200 mg/L、肌醇100 mg/L、蔗糖30 mg/L、植物凝胶2.6mg/L或琼脂粉6 mg/L；愈伤组织诱导及继代培养基：基本培养基附加 2，4-D 2 mg/L和10 mg/L AgNO3；选择培养基：愈伤组织诱导或继代培养基附加不同浓度草丁膦和10 mg/L AgNO3；胚状体诱导培养基：基本培养基附加1.5 mg/L KT；分化培养基：同基本培养基；生根壮苗培养基：基本培养基附加0.5 mg/L NAA。

1.2.4 基因枪轰击方法与参数 参见文献［16］的方法进行。

1.2.5 胚性愈伤组织的筛选

1.2.5.1 胚性愈伤组织的恢复培养 将用基因枪轰击后的胚性愈伤组织，在原培养皿中、暗处恢复培养3-5 d以便修复由微弹复合体对受体细胞造成的损伤。

1.2.5.2 胚性愈伤组织的继代筛选 将恢复培养后的胚性愈伤组织接种在附加草丁膦6 mg/L筛选继代培养基筛选15 d。然后，将存活的抗性愈伤转接到草丁膦10 mg/L的筛选继代培养基上进行第2次筛选15 d。

1.2.6 植株的再生及移栽 抗性愈伤组织在附加1.5 mg/L KT的胚状体诱导培养基上培养一周后，转移至分化培养基进行绿苗分化。分化的绿苗长出主茎后，将其移至生根壮苗培养基上生根壮苗。待幼苗长出 2片新叶、3-4条主根后，移至装有营养土（2/3蛭石+1/3腐殖质）的小花盆中。当幼苗在小花盆中长出 1-2片新叶，带土移栽到大田。

1.2.7 再生植株的分子检测

1.2.7.1 选取草丁膦抗性的植株，用CTAB法提取叶片总DNA，利用PCR对P5CS基因进行检测。根据P5CS基因的序列设计引物为：上游引物：22 bp 5'-CTCTCTACGATACGCTGTTCAC-3'；下游引物：20 bp 5'-CTTCTTTGCCACCTTTCAAG-3'；阳性转基因植株可扩增出1 008 bp的片段。PCR采用由东盛公司生产的扩增仪。

1.2.7.2 PCR阳性植株的Northern blot 鉴定 取经PCR检测呈阳性的植株进行Northern blot 分析，以未转基因的野生型植株的RNA为阴性对照。探针标记和杂交检测按照Roche公司的地高辛试剂盒的方法进行，杂交温度为41℃。具体参见文献［19］的方法进行。

1.2.8 脯氨酸含量测定 对部分转基因玉米植株和对照植株进行干旱处理，测定幼苗叶片脯氨酸含量。叶片脯氨酸含量的测定按Bates和张殿忠等［20，21］的方法进行。数据为3次独立实验的平均值。

1.2.9 叶片丙二醛（MDA）含量测定 丙二醛（MDA）含量通过与硫代巴比妥酸的颜色反应来测定［22，23］。

2 结果

2.1 胚性愈伤组织的筛选和植株再生

用不同浓度的草丁膦对幼胚愈伤组织进行两次筛选。第1次是在附加草丁膦6 mg/L筛选继代培养基筛选15 d，愈伤组织的成活率在30%左右。然后，将存活的抗性愈伤转接到草丁膦10 mg/L的筛选继代培养基上进行第2次筛选15 d。在愈伤组织筛选过程中，非抗性愈伤组织块会逐渐褐化变黑而死亡，25-35 d后，大部分（90%-95%）愈伤组织被杀死，只有少部分（5%-10%）愈伤组织能够存活下来（抗性愈伤组织）并逐渐长出绿色的小芽点，再经过10-20 d后，发育成具有茎和叶的小植株，最后在生根培养基上发育成完整的植株（图2）。

图2 玉米植株再生体系的建立

2.2 转基因玉米植株的分子检测

用设计好的引物对草丁膦抗性植株进行P5CS基因的PCR检测，转基因植株的P5CS基因扩增带位置与质粒阳性对照扩增带位置相同，而阴性对照及其他植株无扩增带（图3-A）。经检测，共得到11株PCR阳性植株，阳性率70%。

为了检测目的基因在转基因植株中是否表达，从野生型和3个转基因植株叶片中提取总RNA，进行Northern blot分析。每个泳道RNA上样量为15 μg，探针为地高辛标记的P5CS cDNA特异探针，溴化乙锭染色的rRNA作内参，Northern杂交检测结果如图3-B所示。在未转基因的对照植株中未出现扩增产物，而在各转基因植株株系中目的基因均有不同程度的表达。根据目的基因表达强度，选择株系L2、L9进行抗旱性实验。

2.3 转基因植株的脯氨酸含量增加

为了解在干旱胁迫处理条件下转基因植株脯氨酸积累的变化，测定了转基因植株和对照植株叶片脯氨酸的含量。在干旱胁迫处理之前，叶片脯氨酸含量在转基因植株和对照植株之间没有显著差异，含量都较低。干旱胁迫引起转基因植株叶片脯氨酸含量有不同程度的上升。在干旱胁迫处理过程中，转基因植株叶片脯氨酸的含量都显著高于其对照植株。如在正常条件下，WT、L2和L9植株的脯氨酸含量分别为23.4、24.1和26.5 μg/g·FW，没有显著差异。干旱胁迫处理3 d后，L2和L9植株脯氨酸含量分别上升为63.7和66.1 μg/g·FW，显著高于WT植株的51.3 μg/g·FW，转基因植株叶片脯氨酸含量比对照株高24.2%-28.8%（图4，表1）。这些结果表明转基因植株细胞可以积累更多的脯氨酸，使细胞能够维持较低的溶质势，从而能够更好地保持水分，减少或免受干旱胁迫的伤害。与对照相比，转基因植株对干旱胁迫具有较强的耐性。

图4 干旱胁迫引起的玉米幼苗脯氨酸含量的变化

表1 不同株系在不同处理时间条件下脯氨酸的含量（μg/g·FW）变化

2.4 转基因植株具有较低的丙二醛含量

干旱胁迫条件下，玉米叶片失水萎蔫，叶片细胞内活性氧含量上升，使细胞膜脂成分发生氧化，脂质过氧化产物为丙二醛（MDA），MDA能与蛋白质等交联导致酶失活或膜系统受损，因此，植物体内MDA含量的高低可在一定程度上反映玉米植株在干旱胁迫条件下膜脂过氧化的程度的大小。结果表明：在干旱胁迫处理前，各株系的丙二醛含量差别较小，且随着干旱胁迫处理时间的延长而升高（图5，表2）。相同处理时间下转基因株系与对照株系相比测定值要低。如在干旱胁迫处理第3天时，L2和L9的MDA含量分别为18.8 nmol/g FW，14.0 nmol/g FW，而WT的测定值达到了21.5 nmol/g FW。这些结果表明，在干旱胁迫下转P5CS基因植株的细胞膜损伤较轻，有利于植株的生长，使转基因植株抗旱性得到提高。

图5 干旱胁迫引起的玉米幼苗丙二醛含量的变化

表2 不同株系在不同处理时间条件下丙二醛的含量（nmol/g·FW）变化

3 讨论

环境中，植物常常遭受干旱胁迫。植物通过激活一系列信号途径来响应胁迫，使植物能抵御或适应干旱胁迫。干旱可以产生细胞伤害和次生胁迫，如渗透和氧化胁迫。通过信号感知和转导，启动下游信号程序和转录调控机制，激活胁迫响应机制（如脯氨酸参与的渗透保护）以重建平衡，保护和修复受伤害蛋白和各种膜，从而赋予植物胁迫耐性［24］。

干旱是影响植物生长发育的重要因素，通过渗透胁迫影响植物细胞膨压从而导致植物的不良生长。在渗透胁迫下，植物将产生一些渗透调节物质抵抗该胁迫，包括脯氨酸和甜菜碱。脯氨酸主要来源于谷氨酸合成途径［25］。研究表明，由P5CS基因编码的Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是渗透胁迫时植物体内合成脯氨酸的关键酶，单独转化P5CS基因的植株可以提高脯氨酸的含量，起到抗旱的作用［26］。

自从1992年第一个高等植物的P5CS基因从豇豆中克隆以来，在许多植物中克隆出该基因。据不完全统计，仅从2010年以来就从20多种植物中成功克隆了P5CS基因［27-53］。同时，利用豇豆P5CS基因转化高羊茅［16］、冰草［54］、白三叶［17］，多年生黑麦草P5CS基因转化拟南芥［55］，普通菜豆PvP5CS1基因转化拟南芥［56］、PvP5CS2基因转化烟草［56］，朝鲜碱茅P5CS基因转化紫花苜蓿［57］，新牧一号苜蓿MvP5CS基因转化棉花［58］，拟南芥P5CS1基因转化羽衣甘蓝［47］和马铃薯［59］均获得成功。

实验证实，转化P5CS基因可显著提高多种植物的脯氨酸水平［60-63］。转基因植株比对照植株最低也高达20.0%［17］，有的高达12倍［61］，耐旱性也有不同程度的提高。研究还发现，脯氨酸在调控植物体内蛋白合成和细胞周期转换中起重要作用，脯氨酸可以保护遭受渗透伤害的发育中的细胞［49］。脯氨酸合成不足会导致周期蛋白基因和其他细胞周期相关基因的表达下调，暗示脯氨酸可以作为植物发育中的信号分子参与细胞信号转导过程［64］。

为进一步探讨植物抗旱的生理机制，Singh等［65］比较了两种棉花的干旱耐性相关基因的差异表达谱和生理表现。结果显示，在干旱条件下，生理指标诸如净光合速率、蒸腾、气孔导度、叶绿素荧光、相对含水量（RWC）和水势都会发生变化，而脯氨酸、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）含量会随着其相关基因表达改变而增加。中度胁迫下，耐旱品种保持较低的水势可能是由于与敏感品种相比具有的较高脯氨酸含量。基因表达分析显示，耐旱品种通过上调天冬酰胺合成酶调节（AS）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和甲基乙二醛（glyI）基因表达增强解毒机制，同时，耐旱品种通过上调Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因增强脯氨酸，一种渗透调节物质的积累［65］。研究也发现，玉米在长期遭受非生物逆境胁迫尤其是干旱胁迫条件下，细胞内离子平衡遭到破坏，从而影响一系列代谢通路，导致多种生理活动出现紊乱，最终对植物生长发育产生抑制作用［3］。

为了提高玉米对干旱胁迫的适应能力，将来自豇豆的P5CS基因转化玉米。首先通过不同植物生长调节剂组合，建立了基于玉米幼胚的遗传转化体系；其次采用基因枪转化法将P5CS基因转化到玉米基因组中，并通过PCR和Northern blot检测，验证了目的基因已转入到玉米基因组中并得到表达。

另外，通过探讨转基因植株在干旱胁迫条件下的生理生化变化对其抗旱性进行了初步研究。测定了转基因植株和对照植株的脯氨酸含量。从本实验的结果来看，干旱胁迫下，转基因玉米植株中脯氨酸含量的增加明显高于对照植株，如干旱胁迫处理3 d后，转基因株系L9植株脯氨酸含量为66.1 μg/g·FW，显著高于WT植株的51.3 μg/g·FW（图4，表1），说明转基因植株的细胞能够维持较低的溶质势，抵御干旱胁迫能力较强。

水分胁迫会造成植物细胞原生质膜的损伤，破坏质膜的结构，使其稳定性降低，透性增大，干旱胁迫也会使细胞膜脂成分发生氧化，脂质过氧化产物主要是丙二醛（MDA）。MDA（丙二醛）含量越高，反映植物抗旱性越弱，反之，则植物抗旱性强。质膜伤害度增值与抗旱性为显著负相关［66］。转基因植株和对照植株的MDA含量测定结果显示，相同处理时间下转基因株系的MDA比对照株系的要低。在干旱胁迫处理第3天时，L9的MDA含量分别为14.0 nmol/g·FW，而WT的测定值达到了21.5 nmol/g·FW。表明干旱胁迫下，与对照植株相比，转基因植株的膜脂过氧化程度较轻，细胞膜稳定性较高，抗旱性较强（图5，表2）。在干旱胁迫下转P5CS基因植株可以通过降低细胞膜损伤提高干旱耐性。以上实验结果表明转P5CS基因玉米的抗旱性得到了一定提高。后续将对转基因植株进行田间抗旱性分析，筛选抗旱性较强的转基因玉米新材料，为玉米抗旱育种提供中间材料。

近年来，P5CS基因对提高植物抗旱能力在抗逆基因工程上的应用不断得到研究探讨与证实，这些研究应用将为抗旱植物的培育及真正运用于大田生产奠定坚实的基础。目前，我国玉米产量和品质虽有一定提高但仍继续进行改良，考虑到目前转基因玉米的应用主要集中在抗虫、抗除草剂方面，而对于中国北方大面积的缺水现状而言，利用不同遗传背景的P5CS基因转化玉米，增加玉米的抗旱性，获得具有优良性状并能稳定遗传的耐旱玉米新品种将具有重要的经济和实践意义，因而具有广阔的应用前景。

4 结论

本实验的研究表明，豇豆P5CS基因已整合进转基因玉米基因组中并能够在植株中表达。干旱胁迫下，转P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比对照高，而丙二醛含量比对照要低，转基因玉米植株的抗旱性得到提高。

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（责任编辑 狄艳红）

The Transformation of Drought-resistant Gene into Maize by Microprojectile Bombardment

LI Zhi-liang1，2，5WU Zhong-yi2YANG Qing3ZHANG Xi-tai4YE Jia1，5XING Hao-chun1，5CHEN Jian-zhong1，5HUANG Cong-lin2
（1. College of Life Sciences and Engineering，Handan University，Handan 056005；2. Beijing Research Center of Agro-Biotechnology，Beijing 100097；3. College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；4. Handan Academy of Agricultural Sciences in Hebei Province，Handan 056001；5. Application Technology Research and Development Center of Wild Resource Plants in Taihang Mountain Area of Southern Hebei for Hebei Institutions of Higher Education，Handan 056005）

A drought-resistance function gene，VaP5CS，was cloned from mothbean（Vigna aconitifolia）. Plant expression vector pBPC-P5CS-F129A was constructed using gene engineering strategy，then the genetic transformation of young embryo callus in maize inbred line Jing 501 was performed by microprojectile bombardment. Further，the transformed explants were directly selected on the medium containing 10 mg/L glufosinate，and the glufosinate-resistant plantlets were confirmed by PCR amplification and Northern blot identification. Finally，the different drought resistance indexes of P5CS-transgenic maize plants were analyzed. The results showed that the transgenic plants presented the improved drought resistance comparing to control plants. Under drought stress，the proline content in the P5CS-transgenic maize plant was higher than that in the control，while the MDA content was lower than that in the control.

Zea mays；callus；microprojectile bombardment；glufosinate；genetic transformation；drought resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.008

2015-08-05

国家转基因生物新品种培育重大专项资助项目（2009ZX08003-009B），邯郸市科学技术研究与发展计划项目（1322101065），邯郸学院自然科学研究项目（13208）

李志亮，男，博士，副教授，研究方向：植物生理、植物细胞工程和分子生物学；E-mail：zhiliangli09@126.com

黄丛林，男，博士，研究员，研究方向：植物抗旱、抗寒、耐盐分子生物学及基因工程改良；E-mail：huangconglin@hotmail.com