茶树新品系“53-34”父本的EST-SSR标记鉴定

雷 雨，段继华，罗 意，黄飞毅，康彦凯，郭嘉懿，董丽娟，李赛君（湖南省农业科学院 茶叶研究所，国家茶树改良中心湖南分中心，农业部湖南茶树及茶叶加工科学观测实验站，湖南 长沙 410125）



茶树新品系“53-34”父本的EST-SSR标记鉴定

雷 雨，段继华，罗 意，黄飞毅，康彦凯，郭嘉懿，董丽娟，李赛君*
（湖南省农业科学院 茶叶研究所，国家茶树改良中心湖南分中心，农业部湖南茶树及茶叶加工科学观测实验站，湖南 长沙 410125）

摘要：本研究采用EST-SSR标记对茶树新品系“53-34”及其母本和4个可能父本进行了分析。结果表明： 24对引物共检测到69个等位位点，平均2.88；53-34与湘波绿及4个可能父本的相同位点数分别占其扩增总位点数的85.71%、71.43%、65.71%、60.00%、74.26%，最大为湘波绿，最小为福云7号。6份供试材料间相似系数变幅为0.44～0.77，平均0.57。根据相似系数矩阵按UPGMA法进行聚类，在相似系数平均值0.57处可将参试的6份材料划分为三大类：第Ⅰ类高芽齐；第Ⅱ类湘波绿、53-34与古蔺牛皮茶；第Ⅲ类云大72-04与福云7号。参试材料的相似系数和亲缘关系树状图在分子水平上显示了53-34的4个可能父本中，古蔺牛皮茶与其亲缘关系最近，可能为53-34的父本。

关键词：茶树；53-34；EST-SSR；父本鉴定

茶树育种一直是世界主要产茶国的重点工程，也是各国茶叶产业发展的基础。目前茶树种质创新利用和新品种选育的主要手段是单株选育和杂交育种，而杂交育种是茶树创造种质变异的主要方式［1］。茶树新品系“53-34”是以湘波绿为母本，与高芽齐（国家级良种）、福云7号（国家级良种）、古蔺牛皮茶［2］（四川省级良种）及云大72-04（我所从云南大叶种实生后代中选育的一个株系）四个品种（系）的混合花粉人工杂交授粉选育而成。由于为混合花粉，因此确定其父本对开展53-34的鉴定、评价及利用具有重要意义。

DNA分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平遗传变异的直接反映，不受环境与基因表达与否的限制，数量多、多态性高、遗传稳定［3］。分子标记根据原理不同分为RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR、STMS、SCAR、SNP等，现已广泛应用于高密度遗传图谱的构建、基因定位和克隆、植物亲缘关系鉴别及遗传多样性研究、分子标记辅助选择育种等领域［4］。DNA分子标记技术应用于鉴别茶树品种间的亲子关系已有相关报道［5-10］。

EST-SSR（expressed sequence tag based simple sequence repeat）是在搜索 EST中微卫星的基础上，根据微卫星两侧的已知序列来设计引物，进而对动植物进行标记研究的一种方法。ESTSSR标记具有多态性高、共显性遗传、技术简单、重复性好、数量丰富和对基因组有很好的覆盖性等特点［11-12］。本研究利用EST-SSR标记，结合参试材料间的相同位点比较、相似系数及在此基础上的树状图对茶树新品系“53-34”及它的母本湘波绿和4个可能父本进行亲缘关系和遗传背景分析，以明确53-34的父本，进一步研究茶树遗传规律，为茶树亲本选配、单株选择及分子标记辅助育种提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

供试材料6份，分别为高芽齐、湘波绿、53-34、云大72-04、福云7号、古蔺牛皮茶。2014年4下旬，在本所茶树种质资源圃，取一芽二叶新梢，用液氮迅速冷冻后放入-80℃冰箱中保存备用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取

采用改进的SDS法［13］提取基因组DNA。 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，WF2800-D3B分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）测定DNA浓度。

1.2.2引物合成

24对EST-SSR引物参照刘振等［14］和Zhao等［15］的引物编号和序列，由长沙鼎国生物技术有限公司合成。

1.2.3PCR扩增和产物检测

PCR扩增在Mastercycler 5322型PCR仪（Eppendorf Biotech. Int’l Trade CO.，Ltd）上进行，扩增体系、凝胶电泳及银染显色参照姚明哲等［13］的方法。电泳在JY-SCZ7型电泳仪（北京六一仪器厂）上进行。用Tannon2500R凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）拍照记录。

1.3数据处理

利用人工方法读带，将电泳图上可重复、清晰的条带记为“1”，同一位置无带或不易分辨的弱带计为“0”，建立原始数据矩阵。计算每对引物扩增位点的多态性信息量（polymorphism information content， PIC），PIC= 1-ΣPi2，式中Pi表示第 i 个等位位点出现的频率［16］。采用NTSYS2.1软件［17］计算供试材料间的遗传相似系数，按UPGMA （unweighted pair group method using arith- metic averages）法聚类，并绘制树状聚类图。

2　结果分析

2.1引物扩增的等位位点数及多态性

24对引物在供试材料间共检测到等位位点69个（表1），平均每对引物可检测到2.88个，其中最多的为（引物A90）5个，最少的为2个（引物228、SSR8、A157、A113、1110、663、A58、A55、SSR4）。引物的多态性信息含量（PIC）最大为0.81，最小为0.23，平均0.51，同时多态性位点数占等位位点的比例达75%。以上结果说明所选用的24对SSR核心引物在参试材料间具有相对较高的多态性。

2.253-34与湘波绿及4个可能父本的相同位点比较

69个等位位点中，53-34共扩增出35个，其中湘波绿及4个可能的父本与其相同的位点数分别占其扩增总位点数的85.71%、71.43%、65.71%、60.00%、74.26%，具有相同位点数最多的是湘波绿，最少的是福云7号。除去53-34与湘波绿的相同位点数（共30个），53-34特有位点共5个，4个可能父本与其具有相同的特有位点数及所占的比例见表2，比例最大的为古蔺牛皮茶（80%），最小的为高芽齐（40%）。

表1　24对引物在6个供试材料中的扩增结果Table 1 The amplifcation information of 24 pairs of primer in 6 accessions

表2　53-34与湘波绿及4个可能父本的等位位点比较Table 2 Comparison of allelic loci between 53-34 withxiangbolv and 4 possible male parents

2.3供试材料间的亲缘关系

从表3可以看出，供试材料间的相似系数变幅为0.44～0.77，平均值为0.57。其中53-34与母本湘波绿的相似系数最大为0.77，四个可能的父本中，53-34与古蔺牛皮茶的相似系数最大为0.62，表明它们之间的亲缘关系较近；湘波绿与福云7号相似系数最小为0.44，表明它们之间的亲缘关系较远。根据相似系数矩阵按UPGMA法进行聚类，在相似系数平均值0.57处将参试的6份材料分为3类：第Ⅰ类高芽齐；第Ⅱ类湘波绿、53-34与古蔺牛皮茶；第Ⅲ类云大72-04与福云7号。

表3　6个供试材料的相似系数Table 3 The similarity coeffcient of 6 accessions

3 　讨论

相似系数是反映亲缘关系远近的直接证据，本研究中，与53-34相似系数最大的是母本湘波绿（0.77），其次是古蔺牛皮茶（0.62），而且它们聚为了一类，说明53-34与湘波绿和古蔺牛皮茶的遗传背景相似度较高，古蔺牛皮茶可能是53-34的父本。同时，53-34与母本及4个可能父本的等位位点比较情况也说明这一点，53-34与母本湘波绿和古蔺牛皮茶所具有的相同位点数最多，比例最大。特有位点中，与古蔺牛皮茶相同位点数比例达到80%。另外，从表型特征来看，53-34制红绿茶品质均优，有花香，具有母本湘波绿的优点；同时又具有父本古蔺牛皮茶较强的抗寒、抗旱能力，芽头肥壮，叶大而光泽，这些均在一定程度上佐证了古蔺牛皮茶是53-34的可能父本。

图1　6份供试材料EST-SSR数据的UPGMA聚类分析树状图Fig.1 Dendrogram of 6 individuals based on EST-SSR date using UPGMA clustering method

参考文献

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Identification of Male Parents for “53-34” Tea Cultivar Based on SSR Markers

LEI Yu，DUAN Ji-hua，LUO Yi，HUANG Fei-yi，KANG Yan-kai，GUO Jia-yi，DONG Li-juan，LI Sai-jun*
（Tea Research Institute of Hunan Academy of Agriculture Sciences； National Center for Tea Improvement， Hunan Branch； Hunan Observation and Experiment Station of Tea Plant and Tea Processing，Ministry of Agriculture，P.R.China， Changsha 410125， China）

Abstract：EST-SRR primers were used to identify the male parents for 53-34 tea cultivar among 4 possible male parents. The result showed that totally 69 alleles were amplifed using 24 core EST-SSR primers， on average of 2.88.The percentage of common alleles with 53-34 is 85.71%， 71.43%， 65.71%， 60.00%， 74.26%， the maximum is Xiangbolv， the minimum is Fuyun 7. The similarity coeffcient among different cultivars varied from 0.44-0.77， on average of 0.57. The 6 accessions were classifed into 3 groups based on the UPGMA method with the similarity coeffcient at 0.57， and the group Ⅰcontained Gaoyaqi； the groupⅡcontained Xiangbolv， 53-34 and Gulin-niupicha； the groupⅢcontained Yunda 72-04，Fuyun 7. The results of the similarity coeffcient and dendrogram showed a closer relationship between 53-34 and Gulinniupicha， Gulin-niupicha is the possible male parent of 53-34.

Key words：Tea， 53-34， EST-SSR， Male parents identifcation

中图分类号：S571.1

文献标识码：A

文章编号：1009-525X（2016）01-28-31

收稿日期：2016-01-06

修订日期：2016-01-25

项目基金：湖南省科技厅重大科技专项（2014FJ1006）

作者简介：雷雨（1982-），女，常德石门人，助理研究员，主要从事茶树种质资源与遗传育种研究。

*通讯作者：李赛君，hnhjhlsj@126.com