千金止带丸中染色剂金胺O的检测方法研究

赵梦杰，魏伯平，孙韬

·炮制制剂·

千金止带丸中染色剂金胺O的检测方法研究

赵梦杰，魏伯平，孙韬

目的：建立千金止带丸中染色剂金胺O的检测方法。方法：采用HPLC-PDA法对千金止带丸中金胺O进行筛查，并采用HPLC- Q-TOF/MS对阳性样品进行确证。结果：对来自7家企业的71批次样品进行筛查和确认发现：有2家企业的11批次样品中检出金胺O；金胺O进样在0.082～82.08 μg．mL-1范围内有良好的线性关系。结论：本方法准确可靠，可作为千金止带丸中金胺O的检测方法。

千金止带丸；金胺O；液相色谱法；液相色谱质谱联用法

千金止带丸由党参、白术、当归、白芍、延胡索等17味药材配伍制成，具有健脾补肾、调经止带等功效，用于脾肾两虚所致的月经不调、带下病的治疗[1]。本方来源于孙思邈的《千金方》，现收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部。其处方中有一味原料药延胡索，市场上发现常被非法染料金胺O染色，使得千金止带丸有金胺O残留的风险[2,3]。金胺O属于工业染色剂，可刺激皮肤黏膜，引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状，人接触或者吸入金胺O会引起中毒。且金胺O较难以自然降解，体内残留物具有致癌、致突变、致畸等毒性，我国在2008年发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》中将其列为非食用物质[4-8]。为保证用药安全，有必要对千金止带丸中金胺O建立检测方法。本文采用HPLC-PDA对千金止带丸中的染色剂金胺O进行筛查，并采用液相色谱-质谱联用（HPLC-Q-TOF/MS）法对阳性结果进行确认。结果：来自7家企业的71批次样品进行筛查和确认发现：有2家企业的11批次样品中检出金胺O；建立了千金止带丸中的染色剂金胺O的检测方法，为打击千金止带丸原料中的非法染色行为提供了技术手段。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国Waters 2695），二级管阵列检测器（美国Waters PDA 2996）；液相色谱联用仪（美国Agilent 1290 ，美国Agilent 6540 Q-TOF/ MS）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；腈、乙酸铵为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。金胺O（中国药品生物制品检定所，批号111770-200701）；千金止带丸样品来源于全国7个生产企业的71批次样品。

2 方法与结果

2.1 HPLC-PDA筛查

2.1.1 供试品溶液制备 本品，研细，取约2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加60%甲醇20 mL，称定重量，超声处理20 min，取出，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 取金胺O对照品适量，加60%甲醇制成每1 mL含2 µg的溶液。

2.1.3 色谱条件与系统适用性试验 采用Waters Xbridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）;流动相：乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液（40：60）；流速：1 mL．min-1;柱温：35 ℃;检测波长为438 nm。理论塔板数按金胺O色谱峰计算，应不得低于3000。取对照品溶液和供试品溶液各5 µL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1。

图1 金胺O对照品（A）、阳性供试品(B)的HPLC图

2.1.4 专属性试验

2.1.4.1 HPLC-PDA法 采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在300～650 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱，千金止带丸阳性样品与金胺O对照的紫外-可见光谱基本一致。结果见图2。

图2 金胺O对照品（A）、阳性供试品(B)的PDA吸收光谱图

2.1.4.2 HPLC- Q-TOF/MS法 离子源：ESI正离子模式；毛细管电压：4500V；干燥气流速：9 L/min ；干燥气温度：350℃；扫描范围：100～500m/z ；起始加速电压：100V (一级)；100V (二级) ；碰撞电压：10～30V; 采样锥电压：60V；其他色谱条件同上。准分子离子与碎片的质谱图见图3。

图3 金胺O对照品（A）、阳性供试品(B)的准分子离子（Ⅰ）与碎片（Ⅱ）的质谱图

2.1.5 筛查结果 共筛查7家企业的71批千金止带丸样品，其中2家企业的11批样品色谱中检出与金胺O对照品色谱保留时间相同的色谱峰，该峰在300～650 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱与对照品基本一致，见表1。

表1 千金止带丸样品筛查结果

2.1.6 阳性样品确认 2家企业的11批千金止带丸样品采用HPLC-Q-TOF/MS进行确认，在与金胺O对照品色谱保留时间相同的位置出现色谱峰，且与对照的准分子离子和碎片离子质谱图基本一致。

2.2 HPLC含量测定

供试品溶液、对照品溶液的制备及色谱条件同上“2.1”项下各项。

2.2.1 线性关系考察 取金胺O对照品溶液适量, 加60%甲醇依次稀释为每1mL含金胺O 0.08208、0.4104、1.642、8.208、41.04、82.08 μg．mL-1的标准溶液, 分别取5µL，注入液相色谱仪分析, 以对照品峰面积Y对进样量X（ng）进行线性回归计算，结果：回归方程为Y=9666X-9804, r=0.9995 ，表明金胺O在进样0.082～82.08μg．mL-1的浓度范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验 精密吸取上述浓度为1.642 μg．mL-1的对照品溶液5 µL，连续进样6针，分别记录峰面积，结果金胺O的RSD为1.1%，表明进样精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取千金止带丸，制备供试品溶液各6份，分别注入液相色谱仪，测定并计算，结果金胺O含量平均值为2.4 μg．g-1，RSD为2.1%，表明方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取“2.2.3”项下的同一千金止带丸供试品溶液，室温下放置，精密吸取5 µL，分别在0、2、4、8、16、24h注入液相色谱仪。金胺O色谱峰面积的RSD为1.5%，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收试验 精密称取未检出金胺O的千金止带丸样品2 g，共称定6份,置具塞锥形瓶中，加入41.04 μg．mL-1的金胺O标准溶液0.1 mL，挥干溶剂后，同“2.1.1”项下制备供试品溶液并测定，计算回收率，结果金胺O平均回收率为102.04%，RSD为2.88%，表明该方法的准确度良好，见表2。

表2 加样回收试验结果

2.2.6 检出限和定量限 取“2.1”项下的金胺O对照品溶液，用60%甲醇进行逐步稀释，进样5µL，在选定的色谱条件下, 按信噪比的3倍值和10倍值计算, 测得金胺O的检出限0.02 μg．mL-1，定量限为0.06 μg．mL-1。

2.2.7 样品测定 取千金止带丸阳性样品，照“2.1.1”项下制备供试品溶液并测定，用外标法计算含量，测定结果见表1。

3 讨论

3.1 金胺O裂解碎片分析 碎片离子是二级质谱的重要鉴别点，金胺O的准分子离子m/z268击碎后，一般会产生m/z252、m/z 147，见图4。

图4 金胺O裂解碎片离子

3.2 流动相系统的选择 有文献[8][9]采用乙腈-0.025moL．L-1磷酸盐缓冲液（含0.2%的三乙胺，用磷酸调节pH到3.0）（30：70）分离测定金胺O, 本文采用了更为简单流动相乙腈-0.01moL．L-1乙酸铵溶液（40：60），也取得了满意的分离效果，且可以直接适用于液质联用仪，更为方便。

3.3 本文建立的千金止带丸中金胺O的检测方法，准确迅速，可以有效打击在千金止带丸原料中添加金胺O的违法行为，从结果看，有2家企业的11批次的样品检出金胺O染色剂，表明千金止带丸有被非食用化工染色剂污染的风险，提示企业应定期对影响原料质量的风险因素进行监测分析，监管部门也应定期开展监督检查，防范非食用化工染色剂污染中成药制剂。

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[3] 肖凌,侯俊杰,聂晶,等.元胡止痛系列制剂中金胺O的检测[J].药物分析杂志, 2012,32(11)：2008.

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(责任编辑：李芸霞)

Detection of dye auramine O in Qianjinzhidai pill

/ZHAO Meng-jie1, WEI Bo-ping2, SUN Tao2/(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu, 610097, Sichuan)

Objective:To establish a method for detection of dye auramine O in Qianjinzhidai pills.Method:HPLC-PDA was used as a screening method for auramine O .The positive results were further confirmed by HPLC- Q-TOF/MS.Result:71 batches of qianjinzhidai pills from 7 manufacturer were detected and confirmed. Auramine O was detected from 11 batches of samples in 2 manufacturers. Auramine O had considerable linear relationship in range of 0.082～82.08 μg．mL-1.Conclusion:This method is accurate and reliable, and can be used as the detection method for auramine O in Qianjinzhidai pill．

Qianjinzhidai pill; auramine O; HPLC; HPLC-MS

R 283

A

1674-926X(2016)05-006-03

1. 成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137; 2.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 610097

赵梦杰，女，在读硕士，主要从事中药药效物质基础及其安全性评价研究

Tel：18224472725 Email： 846684378@qq.com

魏伯平，男，主管药师，主要从事中药质量控制与安全性研究 Email：weiboping@gmail.com

2016-03-09