知柏地黄汤对大鼠膜性肾病大剂量激素治疗中的增效减毒作用

李佑生,　廖水玉,2,　李董平,2,　陈玲玲

(1.暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院,广东 深圳 518020;2.暨南大学医学院,广州 510632)

知柏地黄汤对大鼠膜性肾病大剂量激素治疗中的增效减毒作用

李佑生1,廖水玉1,2,李董平1,2,陈玲玲1

(1.暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院,广东 深圳 518020;2.暨南大学医学院,广州 510632)

摘要：探讨了知柏地黄汤对大鼠膜性肾病(Membranous Nephropathy,MN)大剂量激素治疗中的增效减毒作用。针对7周龄SPF级雄性SD大鼠45只,将其分为空白组(C)、模型组(MG)、知柏地黄汤组(ZDD),每组各15只,采用阳离子牛血清白蛋白(C-BSA)、甲泼尼龙琥珀酸钠(MPSS)制备大鼠MN伴激素性骨损伤复合模型,药物干预4周后观察24 h尿蛋白、血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及肾脏、股骨头病理及其半定量分析。结果表明:与MG组比较,ZDD组24 h尿蛋白、血清TC、TG水平显著降低(P<0.01),血清TP、ALB水平显著升高(P<0.01),肾组织病理损害较轻,免疫复合物IgG、补体C3荧光染色较弱,骨组织病理损害较轻。ZDD在对大鼠MN大剂量激素治疗中,可能具有缓解蛋白尿、调节血脂代谢、改善肾脏病理改变的作用,以及改善激素性骨损伤的作用。

关键词：膜性肾病; 骨损伤; 激素; 知柏地黄汤

膜性肾病(MN)是原发性肾小球疾病中常见的病理类型之一,其70%～80%表现为肾病综合征。目前常用的治疗方法是利用糖皮质激素(简称激素)，但激素治疗面临的一个难题是MN多对激素不敏感,难以完全缓解，且95%的MN表现为激素耐药。激素的耐药机制研究表明,耐药主要与糖皮质激素受体功能及基因多态性、免疫因素、脂类因素及肾素血管紧张素系统等有关[1]。对于耐药的治疗,常配合免疫抑制剂治疗,但带来的毒副作用更大[2]。激素治疗面临的另一个难题是毒副作用,其中一个重要的毒副作用是骨损伤问题。目前对激素导致骨损伤的机制认识尚处于研究阶段,对激素导致骨损伤的防治措施主要是应用影响钙磷代谢的药物,如骨化三醇、阿仑磷酸等[3]。这类药物的效果尚不确定,且价格昂贵,不利于长期服用,因此缺乏有效的防治手段。现有研究表明,中西医结合治疗肾病综合征可达到减毒增效的作用,但具体如何结合,仍存在争议[4]。中西医结合对MN提高疗效的同时减轻激素性骨损伤副作用鲜有报道，同时中医药对激素性骨损伤的研究也鲜见提及肾病综合征。在肾病综合征发病的初期,应用大剂量激素的同时,以滋阴降火为主,药用知母、黄柏、生地、丹皮、甘草等,或许可以提高临床疗效[5]。此外,苦味药黄连黄柏的主要有效成分小檗碱对去卵巢大鼠骨质疏松症可能具有防治作用[6]。有研究提出“苦坚肾”理论,以苦味为主组成的复方黄萸方,或许能很好地改善糖尿病肾病蛋白尿,并减轻导致蛋白尿的关键因素之一——足细胞的损伤[7]。因此,本实验拟建立膜性肾病伴有大剂量激素治疗而合并骨损伤的动物模型,从而能更好地观察中药增效减毒的功效。且含治疗上采用含苦味药的知柏地黄汤,拟在动物实验中研究探讨知柏地黄汤对膜性肾病伴激素骨损伤复分模型大鼠的增效减毒作用,以期探索有效的中西医结合治疗MN的方案。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

牛血清白蛋白(BSA,美国Sigma);碳二亚胺盐酸(EDC,美国Aladdin);无水乙二胺(EDA,美国Aladdin);佛氏完全佐剂(美国Sigma公司);总蛋白试剂盒(CSF-终点法,北京利德曼生化股份有限公司);总蛋白试剂盒(积水医疗株式会社);白蛋白试剂盒(积水医疗株式会社);血肌酐测定试剂盒(烟台澳斯邦生物工程有限公司);总胆固醇试剂盒(浙江东瓯诊断产品有限公司);甘油三酯试剂盒(广州科方生物技术有限公司);血尿素氮测定试剂盒(四川麦克生物科技股份有限公司);羊抗大鼠IgG(英国Abcam公司);小鼠抗大鼠C3(英国Abcam公司);7600-020全自动生化分析仪(日本Hitachi);电动多功能直立荧光显微镜(德国 Leica)。

1.2实验动物

SPF级雄性7周龄SD大鼠45只,(200±20) g(广州中医药大学实验动物中心提供,许可证号为SCXK(粤)2013-0034)。

1.3实验药物及药物制备

注射用甲泼尼龙琥珀酸钠由辉瑞制药比利时公司生产,药物剂量为20 mg/(kg·d)。知柏地黄汤(知母20 g、黄柏10 g、熟地黄10 g、山茱萸10 g、山药15 g、丹皮10 g、茯苓10 g、泽泻10 g)的大鼠给药剂量为8.55 g/kg,知柏地黄汤免煎颗粒剂的大鼠剂量为1.325 g/kg,质量浓度为0.265 g/mL。上述中药免煎颗粒剂由深圳华润三九医药股份有限公司生产。

1.4分组

检测各组大鼠24 h尿蛋白定量小于10 mg的纳入实验。将45只大鼠随机分为空白组(C)15只,模型组(MG)15只,知柏地黄汤组(ZDD)15只。

1.5模型制备

1.5.1MN模型制备参考经典Border法以阳离子牛血清的蛋白(C-BSA)制备大鼠MN模型[8]。

预免疫:将等量完全弗氏佐剂和C-BSA乳化后于MG组和ZDD组大鼠皮下多点注射1次,每只0.5 mL。正式免疫:预免疫1周后隔天1次大鼠尾静脉注射C-BSA16 mg/kg,连续4周。C组每日尾静脉注射生理盐水1次,连续4周。

1.5.2骨损伤模型的诱导MG和ZDD组MN造模后腹腔注射甲泼尼龙琥珀酸钠20 mg/(kg·d),治疗MN的同时诱导产生骨损伤,每日1次连续4周[9]。C组腹腔注射对应剂量的超纯水,每日1次,连续4周。

1.6药物干预

ZDD组在甲泼尼龙琥珀酸钠(MPSS)治疗基础上给予知柏地黄汤,每日1次灌胃,连续4周,C组和MG组给予相应剂量的超纯水灌胃,每日1次,连续4周。

1.7实验指标及检测方法

大鼠一般情况、24 h尿蛋白定量、血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)由全自动生化仪检测;免疫复合物IgG、补体C3用间接免疫荧光法检测；肾脏病理用HE、Masson、PAS染色检测；股骨头病理用HE染色检测。

1.8肾脏、股骨头病理半定量分析

肾脏病理半定量法分别对肾小球病变、肾小管间质病变进行评分,肾小球病变主要观察系膜细胞和系膜基质增生程度 (0～4分),积分评定标准为:无,0分;小于25%,1分;25%～50%,2分;51%～75%,3分;大于75%,4分。肾小管间质病变包括间质炎细胞浸润 、间质纤维化和肾小管萎缩(0～4分),依据肾小管间质炎细胞浸润 、间质纤维化和肾小管萎缩面积所占百分比评分:0,0分;小于10%,1分;10%～25%,2分;25%～50%,3分;大于50%,4分。

肾脏荧光染色病理切片在荧光显微镜下镜检观察荧光的强度,标准为:低倍镜下不能显示,高倍镜下似乎可见(±),0分;低倍镜下似乎可见,高倍镜下可见(+)，1分;低倍镜下可见,高倍镜下清晰可见(++)，2分;低倍镜下清晰可见,高倍镜下耀眼(+++),3分;低倍镜下耀眼,高倍镜下刺眼(++++),4分。

光镜下观察股骨头的病理改变,并进行股骨头病理损伤半定量分析。积分评定标准为:0分:骨组织结构、骨骼肌结构、软骨结构正常;骨小梁结构正常;骨髓腔三系造血细胞形态、数量均正常;未见骨组织坏死;未见炎性细胞浸润;未见出血。1分:骨结构基本正常,骨髓腔内造血细胞数量轻度增加,少许炎性细胞浸润。2分:骨结构基本正常,骨髓腔内可见少量脂肪细胞、造血细胞数量增加,骨髓腔内可见小灶性出血或陈旧性出血,炎性细胞浸润。3分:软骨区可见软骨细胞坏死脱落,软骨表面粗糙不平;骨小梁局灶性坏死,骨陷窝消失;骨髓腔内造血细胞数量减少,形态改变,骨髓腔内灶性出血;炎性细胞浸润。

1.9统计方法

采用SPSS17.0统计软件分析。计量数据均以均数±标准差(SD)表示,两组样本间对比采用t检验,非正态分布资料或方差不齐,采用秩和检验,多组比较采用单因素方差分析,多组之间两两比较采用Bonferroni检测,重复测量数据采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠一般情况

MN造模后大鼠出现精神状态差、饮食饮水欠佳、毛发脱落欠光泽、大便溏等症状。药物治疗4周后,ZDD组大鼠精神状态可,饮食饮水量逐渐恢复,毛发脱落缓解,便溏症状明显改善,MG组大鼠用药后精神状态、毛发脱落等症状改善不明显。

2.224 h尿蛋白以及血清TP、ALB、TC、TG、BUN、Scr测定

各组大鼠24 h尿蛋白以及血清ALB、TP、TC、TG、BUN、Scr水平比较如图1所示。MN造模后,MG组、ZDD组24 h尿蛋白超过10 mg,与C组比较,有统计学差异(P<0.01),提示大鼠MN造模成功;ZDD及MPSS治疗第4周末,与C组比较,MG组、ZDD组血清BUN、Scr升高不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与MG组比较,ZDD组24 h尿蛋白定量,血清TC、TG水平显著降低(P<0.01),血清TP、ALB水平显著升高(P<0.01)。

2.3肾脏病理及其半定量分析

肾脏病理结果如图2所示。图中的HE、MASSON、PAS分别指苏木精-伊红染色、马松三色染色和糖原染色。C组大鼠肾组织结构未见异常;ZDD组大鼠肾小球轻度肿大,肾小球囊腔轻度扩张,肾小球囊腔轻度扩张,局部区域肾小管中度扩张伴肾小管上皮细胞轻度脱落,肾间质未见明显淋巴细胞浸润,未见纤维化病变,肾小球毛细血管中度扩张充血,肾小球基底膜轻度增厚;MG组大鼠肾小球中度增大或萎缩,肾小球可见轻度分叶现象,肾小球囊腔中度扩张,局部可见肾小管间质中度纤维化,伴肾小管萎缩,部分肾小管上皮细胞刷状缘脱落,局部区域肾小管间质见少量淋巴细胞浸润,可见肾间质纤维化病变;部分肾小球可见局部壁层上皮细胞轻度增生,肾小球系膜细胞中度增生,肾小球基底膜中度增厚。

图1　各组大鼠 24 h 尿蛋白定量以及血清 ALB、 TP、 TC、 TG、 BUN、 Scr 水平比较

图2　各组大鼠肾脏镜下结构观察结果

肾小球病理积分结果表明,与MG组相比,ZDD组大鼠肾小球病理积分明显降低(P<0.01)。肾小管间质病理积分结果表明,与MG组相比,ZDD组大鼠肾小管间质病理积分明显降低(P<0.05),结果见表1。

间接免疫荧光结果如图3所示，较C组大鼠肾小球毛细血管袢,MG组可见IgG和补体C3呈较为粗大颗粒状,沿肾小球毛细血管袢呈弥漫性分布,染色呈强阳性(+++);ZDD组大鼠可见IgG和C3呈较小颗粒状,沿肾小球毛细血管袢分布,染色呈阳性(++)。

表1　不同分组大鼠肾脏病变半定量评分情况

N=14

图3　各组大鼠肾脏免疫荧光观察结果

肾脏免疫荧光积分结果见表2,与MG组相比,ZDD组大鼠肾脏免疫荧光积分明显降低(P<0.01)。

表2　不同分组大鼠肾脏免疫荧光定量评分情况

N=14

2.4股骨头病理及其半定量分析

股骨骨头病理结果如图4所示。C组大鼠关节部位骨组织结构未见异常;ZDD组大鼠骨小梁结构正常,未见坏死,未见炎性细胞浸润;骨髓腔内可见少量脂肪细胞,骨髓腔内可见少量红细胞,为小灶性出血,部分骨髓腔内造血细胞数量轻度增加;MG组大鼠关节软骨区可见软骨细胞坏死脱落,伴炎性细胞灶性浸润,软骨表面粗糙不平。部分骨髓腔内造血细胞数量减少,形态改变。

股骨头病理损伤积分结果见表3,与MG组相比,ZDD组大鼠股骨头病理积分明显降低(P<0.01)。

图4　各组大鼠股骨头镜下结构观察结果

GroupPathologicalfeatureintegraloffemoralheadMG34ZDD14F/χ20.684P0.009

N=14

3讨论

目前MN的主要治疗方法有药物治疗(如ACEI、ARB)、激素和免疫抑制剂，以及一些对症治疗等[10]，其中激素法仍是目前最主要的治疗方法与手段。在MN的治疗中,激素治疗的缓解率低,尤其是长期激素治疗还存在诸多毒副作用。骨损伤是激素长期应用中的一个重要副作用,对中老年患者尤显突出。现有的肾脏病治疗指南推荐在超过3个月的大剂量类固醇治疗的患者中,应预防骨质疏松,但现有研究报道激素性骨损伤防治措施的疗效待进一步考察[11]。

本实验采用中西医结合治疗MN,即在大剂量激素治疗MN的同时,给予知柏地黄汤,观察知柏地黄汤对MN的增效减毒作用。

从中医理论分析,蛋白作为精微物质从体内流失,当属肾之封藏失司,固摄无权所致,即《诸病源候论》中论述“劳伤肾虚,不能藏于精,故因小便而精微出也”。因此对于蛋白尿的治疗,固肾当属重要的治疗法则。一般临床补肾固涩多用酸收之品,但用其疗效并不理想。《素问·藏气法时论》明确指出“肾欲坚,急食苦以坚之,以苦补之,咸写之”。“苦坚肾”可以理解为苦味药具有藏精固肾的功效。知柏地黄汤在补肾方的基础上,加以知母黄柏“苦坚肾”以固肾。

激素为温热阳燥、纯阳之品,长期大量使用必然会耗伤机体阴精,阴不制阳,机体阴阳平衡被破坏,则出现阴虚火旺的症候,因此可在MN大剂量激素治疗阶段采取滋阴降火的治疗法则,知柏地黄汤为滋阴降火良方。

激素导致的骨损伤从中医理论认识来讲也与肾相关,肾的功能不仅主藏精,还主骨,也就是说,骨的病变多从肾虚来认识与治疗。因此,“苦坚肾”的科学内涵不仅体现在固肾,还体现对骨的作用,即间接补肾、壮骨。知柏地黄汤中知柏、地黄即有“苦坚肾”之意。

本实验在大剂量激素使用阶段配合应用知柏地黄汤方进行治疗,实验结果表明,ZDD结合MPSS治疗MN可能可以缓解蛋白尿、调节血脂代谢及进一步改善肾脏病理改变,并能同时起到减轻激素性骨损伤的减毒作用。知柏地黄汤可能通过增强机体的抗氧化能力,加速自由基及其代谢产物的消除,减轻体内的脂质过氧化反应,促进蛋白质的合成,从而改善高脂血症和低蛋白血症[12]。研究表明苦味药黄柏中所含小檗碱可能通过调节黏附因子的表达,改善足细胞黏附功能,从而降低蛋白尿,延缓肾病的进展[13]。黄柏还可能通过影响骨髓间充质干细胞成骨分化来减轻激素的副作用[14]。可见ZDD在MN大鼠大剂量激素治疗中,可以在一定程度上提高疗效,减轻激素性骨损伤的不良反应。但本实验仅观察到了短期副作用骨损伤的出现,对部分长期副作用,特别是骨质疏松,可在激素应用甚至停用后数年乃至数十年后出现,因此需延长干预时间和扩大大鼠样本量来进行深入研究。苦味药对激素性骨损伤的作用机理也有待进一步的研究。寻求有效的最佳治疗方法,从而最大限度地减少激素的不良反应,提高临床疗效,提高患者的生活质量,仍是今后MN治疗方案的一个重大课题,值得进一步研究、探索。

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Efficacy Enhancing and Toxicity Reducing Effect of Zhibai Dihuang Decoction on Membranous Nephropathy Rats Treating with a Large Dose of Glucocorticoids

LI You-sheng1,LIAO Shui-yu1,2,LI Dong-ping1,2,CHEN Ling-ling1

(1.Second Clinical College of Jinan University,Shenzhen People’s Hospital,Shenzhen 518020,Guangdong,China; 2.Medical College of Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Abstract:The efficacy enhancing and toxicity reducing effect of Zhibai Dihuang Decoction in treating rats with membranous nephropathy (MN) with a large dose of glucocorticoids were studied,aiming at 45 SPF grade male SD rats aged 7 weeks,which were divided into control group (C),model group (MG) and Zhibai Dihuang Decoction group (ZDD),with 15 rats in each group.The MN model with steroid induced bone damage of rats was established with the cationic bovine serum albumin(C-BSA)and methylprednisolone sodium succinate (MPSS).24 h Urinary protein,serum albumin (ALB),total protein (TP),triglyceride (TG),total cholesterol (TC),creatinine (Scr),blood urea nitrogen (BUN),and the pathology of kidney and femoral head and its semiquantitative analysis were observed after the drug intervention for 4 weeks.Compared with these of the MG group,in the ZDD group,the levels of 24 h urine protein,serum TC and TG decreased significantly (P<0.01),the levels of serum TP and ALB increased significantly (P<0.01),the renal tissue was less damaged in pathology,the fluorescent staining of the immune complexes IgG and complement C3 was weaker,and the bone tissue was less damaged in pathology.Conclusion in the treatment with a large dose of glucocorticoids on rats with MN:ZDD may have the effect of alleviating proteinuria,regulating blood lipid metabolism,improving renal pathological changes and improving the steroid induced bone damage.

Key words:membranous nephropathy; steroid induced bone damage; glucocorticords; Zhibai Dihuang Decoction

收稿日期：2015-12-14

基金项目：深圳市科技创新委员会项目(JCYJ20130402092657779)

作者简介：李佑生(1964-),男,湖南长沙人,主任医师,博士,研究方向为中西医结合临床(肾病、代谢病方向)。 通信联系人：廖水玉,E-mail:907336509@qq.com

文章编号：1006-3080(2016)02-0187-07

DOI:10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.02.006

中图分类号：R259

文献标志码：A