CYP4A11基因多态性与脑梗死的相关性研究

廖断修，陈 洪，易兴阳，何 妮，王 淳，林 静

(1.四川省德阳市人民医院神经内科，四川 德阳 618000；2.温州医科大学第三附属医院神经内科，浙江 温州 325200)

CYP4A11基因多态性与脑梗死的相关性研究

廖断修1，陈 洪1，易兴阳1，何 妮1，王 淳1，林 静2

(1.四川省德阳市人民医院神经内科，四川 德阳 618000；2.温州医科大学第三附属医院神经内科，浙江 温州 325200)

目的 评估CYP4A11基因多态性及其与脑梗死发病及梗死后血管事件的相关性。方法 采用基质辅助激光解吸附电离/飞行时间质谱法(MDLDI-TOF-MS)对396例脑梗死患者及378例对照者的CPYP4 A11rs2269231、CPYP4 A11rs9333025、CYP4F2rs3093135及CYP4F2rs2108622 SNPs进行检测。并对所有的脑梗死患者随访12月。结果 脑梗死组CPYP4 A11rs9333025 GG基因型频率发布明显高于对照组(P< 0.001)。CPYP4 A11rs9333025 GG与脑梗死的发病密切相关(OR=1.82，95%CI：1.24～5.04，P= 0.016)。rs9333025 GG基因型患者在随访期内脑梗死复发率及其他血管事件发生率明显高于rs9333025 AG基因型患者(P= 0.04)。rs9333025 GG为脑梗死后血管事件发生的独立危险因素(RR=1.87，95%CI：1.16～5.36，P= 0.003)。结论 rs9333025 GG基因型增加了脑梗死的易感性和脑梗死后血管事件发生的风险。

脑卒中；细胞色素P450；基因；变异；CYP4A1l；CYP4F2

脑卒中是一组由血管、环境和遗传等多因素参与的复杂疾病，是我国人口死亡的首要死因。而脑梗死占所有脑卒中的80%左右，其病因和发病机制均未完全阐明。CYPω-羟化酶可将花生四烯酸(arachidonic acid，AA)转化为20-羟基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)。20-HETE具有较强的血管收缩功能[1]，在自动调节脑血流量和血压中起重要作用[2]。动物模型研究表明[3]，阻断20-HETE的合成可减小梗死面积大小。CYPω-羟化酶受CYP4A11和CYP4F2基因的编码和调控。有研究表明[4，5]，CYP4A11和CYP4F2基因多态性可能影响其酶的活性，与脑梗死发病相关，然而这些研究均为病例对照研究，没有对患者进行前瞻性随访。本研究旨在探讨CYP4A11和CYP4F2基因4个位点多态性与脑梗死发病及随访期脑梗死复发和其他血管事件发生的相关性，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2010年3月至2013年3月在德阳市人民医院和温州医科大学附属第三医院住院首次发病的急性脑梗死患者(脑梗死组)，均符合中华医学会神经病学分会脑血管病学组制定的诊断标准[6]，均经头颅MRI证实。采用Han等[7]提出的改良TOAST分型方法对脑梗死进行分型，只纳入动脉粥样硬化血栓型(AT)脑梗死及小动脉病变型(SAD)脑梗死。患者及家属均签署知情同意书。排除标准：①心源性脑栓死、其他病因型或原因不明确型脑梗死；②既往有脑卒中病史；③脑出血；④伴严重心、肝、肾疾病；⑤出院后未正规服用阿司匹林等二级预防药物；⑥不愿参与该研究；⑦随访期有2次上述指标未控制在正常范围。共纳入396例，男235例，女161例，年龄46～85岁[(68.8±11.1)

岁]，AT脑梗死260例，SAD脑梗死136例。对照组为同期无脑卒中病史的门诊患者，头部CT检查无颅内病变，无脑卒中家族史，彼此之间及与脑梗死组患者之间无血缘关系。共纳入378例，男222例，女156例，年龄44～78岁[(65.0±10.3)岁]。

1.2 方法

1.2.1 危险因素的评估 仔细询问和登记研究对象一般情况，既往病史，个人史及常见危险因素如吸烟、酗酒情况，有无高血压、糖尿病、冠心病、卒中史等，空腹血检查血常规、凝血常规、生化常规、血脂全套等。

1.2.2 单核苷酸多态性(SNPs)的检测 ①研究位点的选择：参考国外研究位点，此基础上在NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)最新登记的各基因人类SNP，登录人类HapMap计划数据库查找标签SNP(http：//www.hapmap.org/)，设置最小等位基因频率(MAP)≥0.05，获得各基因的标签SNP(TagSNP)，即为本研究各基因研究的位点。据此检测CYP4A11 rs2269231，rs9333025 和CYP4F2 rs2108622，rs3093135等4个位点的基因型。②检测方法：抽取脑梗死患者入院第2天及对照组体检时清晨空腹静脉血2 ml，用乙二胺四乙酸二钠盐抗凝处理，保存于-80 ℃冰箱中备用。采用低渗溶血、酚氯仿法从白细胞中抽提DNA，适量双蒸水溶解，核酸分析仪测定DNA浓度。通过PCR扩增第1个靶序列，然后加入特异性延伸产物将扩增的片段SNPs连接。PCR引物和单碱基延伸引物都使用Assay Designer软件包设计，引物序列见表1。SNPs的分型数据获得是利用PCR的引物延伸和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF；上海生工有限公司)测定[8]。

表1 每个SNP基因型的扩增和延长引物

F：正向引物；R：反向引物

1.3 随访和终点指标

1.3.1 随访方法 出院后嘱患者继续控制血糖、血脂和血压，鼓励患者戒烟戒酒，继续服用抗血小板药物。由专人采用电话、信件、门诊、家访等方式对患者进行12个月随访。每3个月至少门诊随访1次，检查血脂全套、血糖、血压等。

1.3.2 终点指标 ①复发性缺血性卒中(RIS)，包括新发脑梗死和短暂脑缺血发作(TIA)；②深静脉血栓形成(DVT)；③心肌梗死(MI)；④全因死亡；⑤出血事件，包括脑出血和颅外出血。对终点事件采用盲法评估，即评估者不知晓DNA分析的结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2或Fisher确切概率法。脑梗死发生的危险因素分析采用多因素Logistic回归；脑梗死患者卒中后12个月发生血管事件风险采用Cox比例风险模型分析。P< 0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 两组临床特征比较 与对照组比较，脑梗死组患者年龄偏大，患高血压、糖尿病的比例较高(P< 0.05)，两组吸烟、饮酒、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、体重指数(BMI)等比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，见表2。

表2 两组临床特征比较

2.2 两组基因型分布比较 脑梗死组和对照组中4个基因位点的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡(P> 0.05)。脑梗死组患者rs9333025 GG基因型频率分布明显高于对照者(P< 0.001)，而rs2269231、rs2108622和rs3093135各基因型在两组中分布差异均无统计学意义(P> 0.05)，见表3。4个位点基因型在AT和SAD患者之间比较差异也无统计学意义(P> 0.05)。多因素Logistic回归分析表明rs9333025的GG基因型是脑梗死危险因素之一(OR=1.82，95%CI：1.24～5.04，P= 0.016)，见表4。

表3 两组基因型频率分布比较 [n(%)]

表4 脑梗死发生的Logistic回归分析

2.3 不同基因型和危险因素的脑梗死患者随访期终点指标比较 脑梗死组中4例(1.01%)在随访期因外地定居等原因失访，共392例(98.99%)完成随访。随访期有54例患者发生新的血管事件(37例RIS，5例死亡，6例MI，6例DVT)。rs9333025 GG基因型脑梗死患者随访期总血管事件发生率明显高于rs9333025 AG基因型脑梗死患者(P= 0.04)，而其他3个位点各基因型与随访期血管事件发生差异无统计学意义(P> 0.05)。年龄>68岁，AT型脑梗死，伴高血压、糖尿病或高LDL的脑梗死患者与随访期血管事件发生密切相关 (P< 0.05)，见表5。

表5 首次脑梗死后12月内血管事件发生情况 [n(%)]

2.4 脑梗死患者随访期血管事件发生Cox比例风险模型分析 将随访期是否发生血管事件作为应变量，将性别、年龄、高血压、糖尿病、LDL升高、有无吸烟、四个位点的基因型和脑梗死分型等作为自变量进行Cox比例风险模型分析：高血压病(RR=1.46，95%CI：1.06～3.64，P= 0.018)，糖尿病(RR=1.34，95%CI：1.01～3.02，P= 0.036)和携带rs9333025 GG基因型(RR=1.87，95%CI：1.16～5.36，P= 0.003)为脑梗死患者随访期血管事件发生的独立危险因素，见表6。

表6 血管事件发生Cox回归分析

3 讨论

本研究主要目的是研究编码20-HETE合成酶相关基因多态性与脑梗死之间的潜在关联。结果表明，CYP4A11rs9333025多态性是脑梗死发生的独立的危险因素，而CYP4A11rs2269231、CYP4F2 rs2108622和rs3093135则与脑梗死无明显的相关性。这一结果与其他学者研究结果相吻合[9，10]。基于这些研究结果，分析可能原因为CYP4A11 多态性可影响CYP4A11酶的活性，有助于20-HETE的产生，从而导致脑梗死发病风险的增加。

然而本研究结果与某些报道有差异，如Lasker等认为[1]，AA转化为20-HETE过程中CYP4F2是CYP4A11的10倍，同时显示抗 CYP4F2治疗抑制肾微粒体中20-HETE的形成的效果为抗CYP4A11治疗的2倍。Ward等[11]研究表明，是CYP4F2基因而不是CYP4A11基因与20-HETE分泌增加和血压有关。有研究表明CYP4F2基因多态性与缺血性脑卒中独立相关[4，11]。然而，本研究结果没有发现CYP4F2基因多态性与脑梗死的发病相关。造成差异的原因尚不清楚，一个可能的原因是在分子水平有较多因素对脑梗死的发病有关，另一个原因可能是由于种族差异，此外，脑梗死是一组多种危险因素引起的复杂疾病，目前基因多态性与之关系的分析已成为研究热点[12]，但疾病不仅取决于基因-基因、还取决于基因-环境相互作用的结果[13]，本研究没有分析基因-基因交互作用对脑梗死发病的影响，这可能也是差异的原因之一。

目前相关基因多态性与脑梗死易感性研究多为病例对照研究，前瞻性队列研究少。本研究对脑梗死患者进行前瞻性随访12个月，发现CYP4A11rs9333025 GG与脑梗死后随访期血管事件发生密切相关，Cox 比例风险模型分析表明携带 rs9333025 GG基因型的脑梗死患者是脑梗死后血管事件发生的独立危险因素。

本研究结果提示，CYP4A11多态性不仅与脑梗死易感性相关，而且与脑梗死后血管事件发生密切相关。其机制还不完全清楚。可能CYP4A11基因编码CYP4A11酶的活性，参与了花生四烯酸代谢为20-HETE。20-HETE在脑血管的调节中发挥着重要作用：它可以促进氧自由基的形成，导致血管内皮功能障碍[14]；可抑制 Na+，K+-ATP酶活性，是脑血管强效收缩因子[15]；激活细胞内的信号传导通路导致细胞凋亡和细胞死亡[16]。实验研究已表明，抑制20-HETE的合成减少TIA后的脑梗死面积和改善预后[17]。

本研究尚存较多局限，首先，20-HETE水平没有测定，不能确定CYP4A11和CYP4F2基因多态性与20-HETE水平之间的相关性；其次，本研究样本量偏少，仅限于两个中心研究，因此我们的结果还有待于更大样本量和多中心研究来证实；第三，较多的CYP通路基因可能与脑梗死发病有关，本研究则主要集中在编码CYPω-羟化酶相关CYP基因的研究，因此未来的研究应该关注更多的候选基因。

[1] Lasker JM，Chen WB，Wolf I，et al.Formation of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid，a vasoactive and natriuretic eicosanoid，in human kidney.Role of Cyp4F2 and Cyp4 A11[J].J BiolChem，2000，275(6)：4118-4126.

[2] Gebremedhin D，Lange AR，Lowry TF，et al.Production of 20-HETE and its role in autoregulation of cerebral blood flow[J].Circ Res，2000，87(1)：60-65.

[3] Omura T，Tanaka Y，Miyata N，et al.Effect of a new inhibitor of the synthesis of 20-HETE on cerebral ischemia reperfusion injury[J].Stroke，2006，37(5)：1307-1313.

[4] Deng S，Zhu G，Liu F，et al.CYP4F2 gene V433M polymorphism is associated with ischemic stroke in the male Northern Chinese Han population[J].ProgNeuropsychopharmacolBiol Psychiatry，2010，34(4)：664-668.

[5] Ding H，Cui G，Zhang L，et al.Association of common variants of CYP4A11 and CYP4F2 with stroke in the Han Chinese population[J].Pharmacogenet Genomics，2010，20(3)：187-194.

[6] 中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010[J].中华神经科杂志，2010，43(2)：146-153.

[7] Han SW，Kim SH，Lee JY，et al.A new subtype classification of ischemic stroke based on treatment and etiologic mechanism[J].EurNeurol，2007，57(2)：96-102.

[8] Chi LF，Yi XY，Shao MJ，et al.Interaction between ALOX5 AP and CYP3 A5 gene variants significantly increases the risk for cerebral infarctions in Chinese[J].Neuroreport，2014，25(7)：452-457.

[9] Liang JQ，Yan MR，Yang L，et al.Association of a CYP4A11 polymorphism and hypertension in the Mongolian and Han populations of China[J].Genet Mol Res，2014，13(1)：508-517.

[10] Fu Z，Nakayama T，Sato N，et al.Haplotype-based case study of human CYP4A11 gene and cerebral infarction in Japanese subject[J].Endocrine，2008，33(2)：215-222.

[11]Ward NC，Tsai IJ，Barden A，et al.A single nucleotide polymorphism in the CYP4F2 but not CYP4A11 gene is associated with increased 20-HETE excretion and blood pressure[J].Hypertension，2008，51(5)：1393-1398.

[12]张成.基因多态性与缺血性脑血管病[J].实用医院临床杂志，2008，5(2)：30-32.

[13]Schork NJ，Murray SS，Frazer KA，et al.Common vs.rare allele hypotheses for complex diseases[J].CurrOpin Genet Dev，2009，19(3)：212-219.

[14]Singh H，Cheng J，Deng H，et al.Vascular cytochrome P450 4 A expression and 20-hydroxyeicosatetraenoic acid synthesis contribute to endothelial dysfunction in androgen-induced hypertension[J].Hypertension，2007，50(1)：123-129.

[15]Cheng J，Ou JS，Singh H，et al.20-hydroxyeicosatetraenoic acid causes endothelial dysfunction via eNOS uncoupling[J].Am J Physiol Heart CircPhysiol，2008，294(2)：H1018-1026.

[16]Randriamboavonjy V，Busse R，Fleming I.20-HETE-induced contraction of small coronary arteries depends on the activation of Rho-kinase[J].Hypertension，2003，41(3 Pt 2)：801-806.

[17]Tanaka Y，Omura T，Fukasawa M，et al.Continuous inhibition of 20-HETE synthesis by TS-011 improves neurological and functional outcomes after transient focal cerebral ischemia in rats[J].Neurosci Res，2007，59(4)：475-480.

Correlation between Cytochrome (CYP) 4A11 genetic polymorphisms and cerebral infarction

LIAO Duan-xiu1，CHEN Hong1，YI Xing-yang1，HE Ni1，WANG Chun1，LIN Jing2

(1.Department of Neurology，Deyang People’s Hospital，Deyang 618000，China；2.Department of Neurology，The Third Affiliated Hospital，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325200，China)

YIXing-yang

Objective To evaluate the associations between 4 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from the two genes and ischemic stroke as well as atherothrombotic events after stroke.Methods Three hundred and ninety-six patients with ischemic stroke and 378 controls were genotyped for 4 SNPs of the CYP4A11 gene (rs2269231 and rs9333025) and CYP4F2 gene (rs2108622 and rs3093135) using the method of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).All patients were followed up 12-months for atherothrombotic events.Results The frequency of GG genotype of rs9333025 was significantly higher in the ischemic stroke patients than that in controls (P< 0.001).Multiple logistic regression analysis showed that rs9333025 GG was significantly associated with higher risk of ischemic stroke (OR= 1.82，95%CI = 1.24～5.04，P= 0.016).The rs9333025 GG was significantly associated with higher atherothrombotic events than rs9333025 AG during 12 months after stroke (P= 0.04).Multiple Cox regression analysis revealed that the rs9333025 GG was an independent risk factor for atherothrombotic events after adjustment for confounding factors (RR= 1.87，95% CI = 1.16-5.36，P= 0.003).Conclusion rs9333025 GG genotype increases susceptibility to ischemic stroke，and is associated with high frequencies of atherothrombotic events in stroke patients.

Stroke； Cytochrome P450； Genetics； Variants； CYP4 A1l； CYP4F2

R743.33

A

1672-6170(2016)04-0059-05

四川省卫生和计划生育委员会科研基金资助项目(编号：140025)

易兴阳

2015-09-23；

2016-05-23)