先天性胆总管囊肿胆总管上皮紧密连接蛋白表达及其意义

王兴东，汪 健，郭万亮，盛 茂

(苏州大学附属儿童医院 a.病理科，b.普外科，c.影像科，江苏 苏州 215003)

先天性胆总管囊肿胆总管上皮紧密连接蛋白表达及其意义

王兴东a，汪 健b，郭万亮c，盛 茂c

(苏州大学附属儿童医院 a.病理科，b.普外科，c.影像科，江苏 苏州 215003)

目的 了解先天性胆总管囊肿(congenital choledochal cyst，CCC)胆总管上皮紧密连接蛋白表达是否有改变。方法 收集12例儿童CCC胆总管标本，采用免疫组织化学并结合图像分析系统，分析儿童CCC胆总管上皮紧密连接相关蛋白水闸蛋白(occludin)、水闸蛋白-1(claudin-1)表达的改变。结果 CCC组的occludin、claudin-1表达图像分析指标阳性染色得分(MQS)值分别为(44.11±13.824、63)分、(443±23.589)分；对照组分别为(11.298±9.5776)分、(46.098±7.841)分，差异有统计学意义(P= 0.0034，P= 0.0384)。结论 CCC患儿胆总管上皮紧密连接相关蛋白occludin、claudin-1表达增高，提示胆总管上皮屏障破坏。

咬合蛋白；水闸蛋白；先天性胆总管囊肿

先天性胆总管囊肿(congenital choledochal cyst，CCC)好发于婴幼儿，发病原因尚未完全阐明。一种学说认为在胚胎发育中，胆管由实心向空心演变时，有的节段由于发育缓慢，发生狭窄，近端发生扩张。另一种学说认为是胰胆管合流异常所致[1]。CCC可以发生于任何年龄，10岁以下女性儿童多见，延误诊治可以导致胆囊炎、胆系结石。胆道存在慢性炎症进一步造成胆道上皮屏障的破坏，并导致胆道上皮细胞增殖核抗原活性增强、P53、K-ras过表达致使胆道上皮恶性转化[2，3]，但对于CCC胆道上皮屏障破坏后紧密连接相关蛋白表达改变目前尚未见文献报道。

胆道黏膜屏障功能的解剖基础源于胆道上皮细胞间的紧密连接，紧密连接主要由紧密连接相关蛋白组成，紧密连接相关蛋白是非均质复合物，包括咬合蛋白(occludin)、水闸蛋白(claudin) 家族、闭锁小带蛋白(zonula occludens，ZO)家族、连接黏附分子、扣带蛋白(cingulin)、偶对蛋白(symplekin) 等[4，5]。occludin 蛋白准确定位于紧密连接处，在维持细胞间的通透性、保持细胞间的跨上皮电阻有重要意义[6]。claudin 各成员在各种组织中的分布以及功能不同，研究表明claudin-1在消化道黏膜屏障中发挥重要作用[7，8]。

Fallon等[9，10]研究证明，肝外胆道胆汁淤积可以导致ZO-1表达增加，occludin表达2天下降，9天后逐步恢复到与对照组同样水平，然而，Takakuwa 等[11]通过结扎大鼠胆总管6小时后，发现occludin mRNA表达明显增加。已有关于胆道上皮通透性增加导致胆道上皮损伤的报道[12]，而occludin、claudin-1是胆道上皮屏障中的重要分子，主要分布在在人的胆管和胆小管中[13]，而目前对于CCC胆管上皮损伤后紧密连接相关蛋白表达改变未见相关报道。因此阐明CCC导致胆总管紧密连接相关蛋白表达改变，将有助于了解胆道上皮屏障破坏机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究征得苏州大学附属儿童医院伦理委员会同意，采用回顾性分析方法，收集苏州大学附属儿童医院2011～2014年经过影像学检查、手术和病理证实的CCC患儿共12例，男7例，女5例，年龄5月至8岁，中位年龄3岁。收集患者胆总管囊肿标本，采用免疫组织化学SP法进行胆总管紧密连接蛋白occludin、claudin-1染色。对照组来源于我院新生儿或儿童死亡病例胆总管标本，胎龄1天至8岁，中位胎龄为5天。

1.2 方法 ①免疫组化染色：采用SP法。将石蜡包埋的组织连续5 μm切片，切片脱蜡至水，3% H2O2室温孵育30 min 灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗，PBS 浸泡，pH 6.0 枸橼酸盐缓冲液微波炉抗原修复，10%山羊血清封闭非特异性染色。滴加不同比例稀释的一抗occludin(1∶300) (Abcam，Inc.UK)、claudin-1(1∶250)(Abcam，Inc.UK)，置于4 ℃冰箱过夜后在37 ℃水浴恒温箱复温45分钟。加生物素标记二抗，在37 ℃水浴恒温箱反应20分钟； 再加辣根酶标记的链霉卵白素，在37 ℃水浴恒温箱反应20分钟，PBS冲洗4次，每次5 min。DAB-H2O2显色，苏木素淡复染，常规脱水，透明，封片。实验阳性对照由Abcam，Inc(UK)提供的阳性对照片，染色后均为阳性；胆总管上皮细胞柱状，细胞膜呈棕褐色为阳性，在免疫组化中，以PBS液代替一抗作阴性对照，结果均为阴性。②免疫组化图像分析：采用IPP 6.0 图像分析软件定量分析免疫组化染色情况。为了客观分析occludin、claudin-1免疫组化阳性染色的数量和分布，将所有免疫组化染色切片置于显微镜下，采用IPP 6.0图像分析系统。在400倍视野下，每张切片于胆管上皮阳性表达处选择5～8个视野进行拍片，然后保存在计算机上，进行专业图像分析。图像分析选择的指标参照Mady等[14]的方法，计算阳性染色得分(Mean qualifying score，MQS)，即阳性染色比例与阳性表达处平均光密度乘积。将每个切片所选择的视野拍片并经过图像分析后，所得数值取平均值后即为该患者的分析指标值。

1.3 统计学方法 采用SAS V8.1统计软件进行数据处理。观察指标采用均数±标准差表示，根据资料分布和方差齐性检验，对于不能满足t检验的，采用Wilcoxon法检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组织化学染色图像分析结果显示，胆总管上皮细胞呈柱状，claudin-1主要呈细胞膜表达，部分细胞质核和细胞核呈弱阳性表达(图1)。CCC组中claudin-1表达图像分析指标值MQS高于对照组，差异有统计学意义(P= 0.0384)。occludin主要在细胞膜表达，呈中等程度表达，细胞质及细胞核无明显阳性表达(图2)。CCC组中occludin表达图像分析指标值MQ高于对照组差异有统计学意义(P= 0.0034)，见表1。

图1 claudin-1免疫组化染色图象 claudin-1主要呈细胞膜高表达，部分细胞质核和细胞核呈弱阳性表达

图2 occludin免疫组化染色图像 occludin于细胞膜呈中等程度表达

组别occlindinclaudin-1CCC组(n=12)44.11±13.82463.443±23.589对照组(n=10)11.298±9.577646.098±7.841Z-3.2978-2.2089P0.00340.0384

3 讨论

紧密连接是使紧靠在一起的相邻细胞形成环绕的物质屏障结构，具有细胞粘附、维持细胞极性和选择性通透性作用[6，7]。胆管上皮存在紧密连接分子occludin、claudins等构成胆管上皮屏障，将机体与胆道内的外源性物质隔离开来，避免有毒物质和病原微生物的侵袭和炎症因子的损伤[10，11，15，16]。但CCC胆总管上皮屏障相关蛋白及其表达改变目前未见相关报道。

我们的实验发现，CCC胆总管中occludin、claudin1表达增高，与对照组相比差异有统计学意义，结果表明，CCC患者胆总管上皮紧密连接遭到破坏，屏障功能紊乱。Rahner 等通过结扎大鼠胆总管后，观察紧密连接结构与功能及胆汁淤积的关系，其研究结果表明，胆汁淤积程度与紧密连接完整性损伤相关[17]。此外，Fallon等[9，10]通过结扎大鼠胆总管后，结果发现occludin分布发生改变。Takakuwa等[11]通过结扎大鼠胆总管后，发现occludin mRNA表达明显增加，而claudin1-2表达未受影响。以上研究表明胆汁淤积对于紧密连接蛋白表达和分布有影响。而本组资料中CCC患者胆总管远端合并痉挛，与胆道梗阻病理改变相类似，提示胆道上皮屏障功能受损，从而表现为胆道紧密连接蛋白表达的改变。而本研究中claudin-1表达升高，实验结果提示CCC引起的病理改变不单纯是胆汁淤积的问题，紧密连接蛋白的改变可能与CCC合并胰胆管合流异常所致胰液反流有一定关系。研究表明毒素和药物也可以影响胆管屏障功能，可以导致胆管上皮渗透性增加[18]。而CCC合并胰胆管合流异常患者中，由于胰液的返流，其内大分子物质具有很强的毒性，从而可以导致胆管屏障功能的损伤。胆管屏障受损致胆汁成分进入胆道、肝脏间质组织，胆汁诱发的细胞损伤参与胆道疾病发生。已有证据显示胆道疾病的发病与胆道紧密连接和胆管功能有关[2，12]。

总之，本研究对CCC患儿胆总管紧密连接蛋白进行了分析，实验结果显示，随着CCC患儿胆总管上皮屏障紧密连接蛋白分子表达增高，胆总管上皮屏障受损；紧密连接蛋白受到多种信号通路动态调节，多种上皮细胞损伤因素通过激活多种细胞内信号通路来损伤上皮屏障。但CCC胆道上皮受损的具体机制尚需进一步研究。

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Expression and significance of tight-junction associated protein in the common bile duct in pediatric patients with congenital choledochal cyst

WANG Xing-donga，WANG Jianb，GUO Wan-liangc，SHENG Maoc

(a.Department of Pathology，b.General Surgery Department，c.Radiology Department，Children’s Hospital of Soochow University，Suzhou 215003，China)

WANGJian

Objective The aim of this study was to investigate the alteration of tight junction-associated protein expression in the epithelium of common bile duct in pediatric patients with congenital choledochal cyst (CCC).Methods The common bile duct specimens were collected from 12 pediatric patients with CCC.The expression of the tight junction-associated protein related protein occludin and claudin-1 was determined by using immunohistochemistry and image processing system.Results Immunohistochemistry showed that the mean quick scores (MQSs) for occludin and claudin-1 were (44.11 ±13.824) and (63.443 ± 23.589)，respectively，which were significantly higher than those in the controls [occluding：(11.298 ± 9.5776) and claudin-1：(46.098±7.841)，P= 0.0034 and 0.0384，respectively].Conclusion The expression of tight junction-associated proteins occludin and claudin-1 is elevated in the epithelium of common bile duct in pediatric patients with CCC.This indicates that there is the development of disruption in common bile duct epithelial barrier.

Occludin； Claudin-1； Congenital choledochal cyst

江苏省社会发展—重点病种规范化诊疗项目(编号：BE-2015643)，江苏省卫生计生委科研资助项目(编号：H201520)，苏州市应用基础研究项目(编号：SYS201563)

汪健，男，博士，博士生导师，教授。江苏省重点学科“儿科学”首席学科带头人。主要研究方向：儿童消化道畸形临床与基础研究。

R726.1

A

1672-6170(2016)04-0017-03

2016-04-15；

2016-04-20)