原发性肝癌组织中CAIX蛋白的表达及其与微血管密度的关系

赵建波，王豪勋，张 玲，赵晓静，张中冕，周士霞, 段芳龄，马 军

郑州大学第二附属医院1. 消化内科；2肿瘤内科，河南 郑州 450014；3. 河南省肿瘤医院肝胆外科

原发性肝癌组织中CAIX蛋白的表达及其与微血管密度的关系

赵建波1，王豪勋2，张 玲3，赵晓静1，张中冕2，周士霞2, 段芳龄1，马 军1

郑州大学第二附属医院1. 消化内科；2肿瘤内科，河南 郑州 450014；3. 河南省肿瘤医院肝胆外科

目的 研究原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中CAIX的表达及其与微血管密度(MVD)、临床病理特征之间的关系。方法 采用组织芯片和免疫组化方法检测HCC和癌旁组织中CAIX和CD34表达。结果 共收集41例HCC、36例癌旁组织，其中37例HCC和27例癌旁组织有病例资料。CAIX的表达在HCC和癌旁组织间差异无统计学意义(P>0.05)，但HCC组织中CAIX包膜阳性表达率高于癌旁组织，而CAIX胞浆阳性表达率低于癌旁组织，差异有统计学意义 (P<0.05)。HCC组织MVD明显高于癌旁组织(P<0.05)。CAIX阳性的HCC和癌旁组织中MVD均高于CAIX阴性患者，但只有癌旁组织中CAIX阳性组和阴性组间MVD差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CAIX的包膜表达是HCC的特异特征；CAIX高表达HCC患者，血管再生活跃；CAIX可作为HCC治疗的潜在靶点。

原发性肝癌；CAIX蛋白；微血管密度

我国的原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发病主要由乙肝发展而来，随着近几年乙肝疫苗接种的普遍推广，我国的乙肝、及乙肝相关肝癌发病率将逐渐降低[1]。但HCC是我国常见肿瘤之一，根据2015年国家肿瘤登记年报，我国HCC的发病率居第四位(21.35/10万)，死亡率居第二位(18.43/10万)，男性发病率更高。河南作为乙肝高发区，HCC的发病率位居恶性肿瘤发病率第五位(27.04/10万人)，死亡率第四位(23.22/10万人)。

目前HCC的发生机制尚不明确，基因表达水平异常是HCC发生和发展过程中的常见事件，但是哪些基因的异常是HCC发生的驱动基因仍不明确。目前，HCC的靶向药物索拉菲尼已经在临床应用，但疗效更好的靶向药物亟待开发，因此，仍然需要探索更多和HCC相关的基因改变[2]。肝细胞发生癌变的早期即可由于细胞的快速生长而改变周围氧代谢状态，从而引起基因表达异常。CAIX是碳酸酐酶同工酶家族的成员，在肿瘤组织中，可被缺氧诱导因子-1(HIF-1)激活而表达升高，在多种肿瘤中表达明显升高[3]，对于HCC中CAIX的表达情况虽有少量报道[4-7]，但其临床和病理意义尚未完全阐明。本研究利用组织芯片免疫组化方法检测CAIX的表达，分析其在HCC和癌旁组织中的差异，及CAIX与微血管密度(microvessel density，MVD)的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2005年-2006年河南省肿瘤医院肝胆外科HCC及其癌旁组织 (距肿块3 cm)标本，全部病例均为初治患者，术前均未行化疗、放疗或其他治疗。共收取41例HCC组织标本、36例癌旁组织标本；其中37例HCC组织和27例癌旁组织有病例资料。本课题经过医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 主要试剂 HCC组织芯片制作由陕西超英公司协助完成。CAIX兔抗人多克隆抗体(上海生工，AB20346a)；CD34(D155253)；二抗检测试剂盒为DAKO公司产品(K4065, K5007)。

1.3 组织芯片免疫组化方法 组织芯片常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，一抗孵育(4 ℃，过夜)，洗片后加二抗(1∶300)孵育2 h，洗片后加DAB显色剂，苏木素复染，中性树脂封片。CAIX浓度为1∶100，CD34浓度为1∶300。用PBS代替一抗作为阴性对照，预实验中的阳性HCC组织作为阳性对照。

1.4 结果判定 染色结果根据染色强度和染色细胞数量百分比判定。染色强度分为4级(无、弱、中、强染色分别为0、1、2、3分)，染色细胞数分为4级(0～10%、11%～25%、26%～50%、>50%分别记为0、1、2、3分)，根据两项的乘积1分以下为阴性、2分以上为阳性。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验或校正χ2检验；正态分布的计量资料采用t检验，非正态分布的计量资料采用两独立样本的非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC和癌旁组织中的CAIX表达 CAIX在HCC组织中的阳性表达率为56.1%(23/41)，在癌旁组织中的阳性表达率为58.3%(21/36)，两者相比，差异无统计学意义(P>0.05)；但是CAIX在细胞内的表达模式差异有统计学意义(P<0.05)。HCC组织中CAIX包膜阳性表达率为12.2%(5/41)，而癌旁组织阳性表达率只有2.8%(1/36)；HCC组织CAIX胞浆阳性表达率为29.3%(12/41)，癌旁组织为55.6%(20/36)；HCC组织CAIX胞浆+包膜阳性表达率为14.6%(6/41)，而癌旁组织CAIX无胞浆+包膜表达(见图1)。HCC组织中CAIX包膜阳性表达率高于癌旁组织，而胞浆阳性表达率低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

所收集的标本中，有临床资料的HCC组织有37例、癌旁组织有27例。其中HBsAg阳性患者30例(81.1%)；年龄≤60岁的患者31例(83.8%)；男性患者30例(81.1%)(见表1)。经统计学分析，无论是HCC组织，还是癌旁组织，CAIX表达均与HBsAg、年龄、性别、远处或淋巴结转移、被膜侵犯和切缘是否癌细胞阳性无相关性(P均>0.05)。

表1 HCC组织中CAIX表达和病理临床资料的相关性 [例数(%)]

Tab 1 Correlation between CAIX expression in HCC and clinical pathological data [n(%)]

例数HCC组织中CAIX阳性表达例数癌旁组织中CAIX阳性表达年龄(岁) ≤603117(54.8)2313(56.5) >6062(33.3)43(75.0)性别 男3016(53.3)2113(61.9) 女73(42.9)63(50.0)HBsAg 阳性3016(53.3)2111(52.4) 阴性73(42.9)65(83.3)淋巴结转移 有63(50.0)44(100) 无3116(51.6)2312(52.2)

续表1

例数HCC组织中CAIX阳性表达例数癌旁组织中CAIX阳性表达远处转移 有63(50.0)53(60.0) 无3116(51.6)2213(59.1)包膜侵犯 有219(42.9)1710(58.9) 无1610(62.5)106(60.0)切缘 阳性2312(52.2)1912(63.2) 阴性147(50.0)84(50.0)

2.2 HCC和癌旁组织CAIX和MVD的关系 本组织芯片中每个标本大小为1 mm2，计数全部视野中CD34阳性染色的血管数，计算微血管个数。根据文献[8]报道的方法，其中相连的阳性血管计为1个，不计有平滑肌组织的血管，不计直径超过8个红细胞的血管。研究发现，HCC组织中MVD为(59.38±57.02)个/mm2，癌旁组织(28.76±25.53)个/mm2，两者相比，差异有统计学意义(P=0.042)。HCC组织中，CAIX阳性组MVD为(71.9±63.0)/mm2，CAIX阴性组MVD为(43.4±45.2)/ mm2；两组相比，差异有统计学意义(P=0.06)。癌旁组织中，CAIX阳性组MVD为(38.0±27.7)/mm2，CAIX阴性组为(15.9±15.1)/mm2；两组相比，差异有统计学意义(P=0.008)。因各组MVD值不符合正态分布，以上结果均使用两独立样本非参数检验。癌旁组织中，淋巴结转移阳性组和阴性组MVD有明显统计学差异外(P=0.034)，年龄、性别、HBsAg、远处转移、被膜侵犯、切缘侵犯与MVD无明显相关性；HCC组织中的MVD与年龄、性别、HBsAg、淋巴结转移、远处转移、被膜侵犯、切缘侵犯均无明显相关性。

3 讨论

3.1 HCC和癌旁组织中CAIX的表达模式不同 碳酸酐酶(CA)的同工酶至少有16种，有些同工酶存在于细胞质，有些为跨膜蛋白，有些分布于线粒体，有些存在于唾液或乳汁中。CAIX是一种跨膜蛋白酶，是由人宫颈癌细胞系中发现的，最初命名为MN，随后发现MN的氨基酸序列和已发现的CA的序列具有高度同源性，是CA的异构酶，遂将其命名为CAIX。在已发表的文献中，CAIX多表达于肿瘤组织，如在宫颈癌中的表达率高达90%，直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、食管鳞癌、胰腺癌、肺癌等也有高表达[9-10]。CAIX在肿瘤组织中的高表达与组织学分级、淋巴结转移、不良预后明显相关。除少数正常组织(如正常胃、胆管、小肠黏膜、胰腺、输精管上皮)表达外，多数正常组织中不表达。CAIX是一种缺氧相关蛋白，可通过抑制E-Cadherin的表达，减少细胞间黏附，促进肿瘤转移[9,11]。

已有报道的HCC中，CAIX的表达率为48.5%[4]，且与年龄、性别、血清AFP、肿瘤大小、组织学分级、临床分期相关，与患者的无进展生存期、5年生存期(OS)也明显相关。而Luong-Player等[6]在HCC中仅检测到15%的阳性率。

本研究中，HCC组织的阳性表达率为56.1%，和台湾人群相似，但癌旁组织中也有高达58.3%的表达率，HCC和癌旁组织无明显差异。但是HCC组织中CAIX包膜阳性表达率高于癌旁组织，而胞浆阳性表达率低于癌旁组织。CAIX是一种跨膜蛋白，文献中报道的免疫组化染色中，CAIX多表现为包膜着色。这种差异是否与所用抗体的结合表位有关，还是与局部组织缺氧情况差异有关，尚需要进一步探讨。另外，Warburg发现，肿瘤细胞在有氧情况下也会表现为糖酵解为主的代谢特征，称为Warburg效应；后人又根据CAIX、Glut-1、BNIP-3等蛋白的表达情况，将肿瘤组织氧代谢分为多种情况，如糖酵解型、非糖酵解型、线粒体功能正常和不正常型等[12]，是否在肝脏肿瘤发生过程中也存在着不同的局部代谢模式，还需要更深入的研究。从本研究结果可以看出，包膜或包膜和胞浆共表达的CAIX可以作为HCC特异指标。

3.2 癌旁组织中CAIX阳性表达的患者MVD增高 恶性肿瘤的发生发展常常伴随着局部组织破坏，新生血管生成。新生血管为肿瘤生长提供了充足的营养物质，并由此导致肿瘤进一步生长、浸润、转移。检测肿瘤组织新生血管的标志物有CD34、CD105、CD31、CD146、vWF等，通过组织血管染色，计算血管密度，作为肿瘤新生血管活跃程度的指标。CD34 是较早用于血管内皮染色的标志物，优于其他几种蛋白标志[13]。本研究通过CD34染色发现，HCC的MVD值明显高于癌旁组织，说明HCC组织中微血管新生活跃。

在一些恶性肿瘤中，CAIX的表达和HIF-1α、GLUT-1、VEGF有关，说明肿瘤的缺氧环境导致局部代谢环境变化，并促进血管的增生，以便为肿瘤细胞提供更多的营养。有文献[14]报道，宫颈癌中缺氧环境下，CAIX高表达，并调控VEGF表达增多，通过血管再生促进肿瘤的淋巴结转移，但尚无文献分析CAIX和MVD之间的联系。本研究中，尽管癌组织微血管生成活跃，CAIX阳性组的MVD值高于CAIX阴性组，但是统计分析结果无明显差异，因此需要进一步扩大样本量来探讨肿瘤组织中两者之间的关系。癌旁组织CAIX阳性组的MVD值高于CAIX阴性组，并具有明显的统计学差异。综合上述结果，说明HCC患者不管在癌组织(尽管本研究中统计量未达到P<0.05)还是癌旁组织，CAIX表达增强，血管再生活跃，提示了CAIX作为肿瘤缺氧指标的可靠性。

CAIX的表达增高是HCC细胞快速增殖、适应缺氧环境的表现。通过CAIX的表达增多，调控其下游的信号通路，刺激血管再生，有利于癌细胞获取营养、生存、增殖。因此，通过抑制CAIX的高表达，阻断肿瘤细胞血管再生的途径，促进其凋亡，可作为新的肿瘤精准治疗靶点[15]。Zhu等[16]在用西地尼布(Cediranib)治疗的HCC患者中，发现外周血CAIX升高者治疗效果差(OS短)。

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Expression of carbonic anhydrase IX and its relationship with microvessel density in hepatocellular carcinoma

ZHAO Jianbo1, WANG Haoxun2, ZHANG Ling3, ZHAO Xiaojing1, ZHANG Zhongmian2, ZHOU Shixia2, DUAN Fangling1, MA Jun1

1. Department of Gastroenterology; 2. Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450014; 3. Department of Hepatic Surgery, He’nan Cancer Hospital, China

Objective To explore the expression of CAIX protein in hepatocellular carcinoma (HCC)and the relationship of its expression with microvessel density(MVD) and clinic-pathological characteristics.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of CAIX and CD34 in tissue array of HCC.Results Forty-one HCC (37 cases with clinic-pathological data) and corresponding 36 para-cancerous tissue (27 cases with clinic-pathological data) were collected. No difference was detected for CAIX expression between HCC tissue para-cancerous tissue(P>0.05). MVD(calculated by CD34 expression) in HCC tissue was higher than that in para-cancerous tissue(P<0.05). MVDs of patients with positive CAIX expression both in HCC tissue and para-cancerous tissue were higher than those with CAIX negative patients, but difference was only found in para-cancerous tissue(P<0.05).Conclusion HCC is characteristic for cellular membrane expression for CAIX protein. HCC patients with higher CAIX protein expression are accompanied with up-regulated microvessel regeneration.

Hepatocellular carcinoma; CAIX protein; Microvessel density

河南省医学科技攻关计划项目、教育部留学人员科技活动项目择优资助[2006]321

马军，E-mail: 843093451@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.07.022

R735.7

A

1006-5709(2016)07-0806-04

2016-05-10