中国汉族人群PRKCDBP基因多态性与炎症性肠病的相关性研究

包文霞，李 岭 ，陶丽华，张海玲，庞 智

1.苏州大学附属第一医院消化科，江苏 苏州 215006； 2.苏州市立医院北区消化科

中国汉族人群PRKCDBP基因多态性与炎症性肠病的相关性研究

包文霞1，李 岭1，陶丽华1，张海玲1，庞 智2

1.苏州大学附属第一医院消化科，江苏 苏州 215006； 2.苏州市立医院北区消化科

目的 初步探讨蛋白激酶C delta结合蛋白(protein kinase C, delta-binding protein, PRKCDBP)基因单核苷酸多态性位点(rs1051992)的遗传多态性与中国汉族人群炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的发病易感性之间的关系。方法 选取81例IBD患者及50名健康体检者作为研究对象，抽提基因组DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, RFLP-PCR)联合基因测序验证检测PRKCDBP基因rs1051992位点基因型，计算基因型及等位基因频率。结果 克罗恩病(Crohn’s disease, CD)组、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)组及正常对照组PRKCDBP基因rs1051992位点基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，CD组与正常对照组、UC组与正常对照组rs1051992(T507C)位点的基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。基因型-临床资料分析发现CD患者基因型分布与性别相关，CT基因型为男性CD患者发病的危险因素(OR=12.8，95%CI: 2.095～78.597，P<0.05)，而与发病部位、疾病行为、有无肛周病变无关。UC患者基因型分布与性别、发病部位无关(P>0.05)。结论 PRKCDBP基因多态性可能与中国男性CD 患者发病相关。

炎症性肠病；PRKCDBP基因；单核苷酸多态性；汉族

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是慢性非特异性胃肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)。IBD发病机制目前仍不明确，流行病学和分子生物学研究均提示IBD具有遗传易感性，主要表现为同卵双生子共患率高、家族聚集现象和不同人种IBD发病的种族差异性。目前为止，全基因组关联研究和IBD的相关Meta分析已经鉴定140种CD易感基因及47种UC易感基因，其中有28种两者均易感。PRKCDBP是一种IBD新的候选基因,是一种肿瘤抑制蛋白，位于染色体11p15.5-15.4。最近，Kim等[1]发现PRKCDBP基因是韩国人口IBD的易感基因，本研究旨在研究PRKCDBP基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与中国汉族人群IBD的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年5月-2015年10月在苏州市立医院及苏州大学附属第一医院门诊或住院的临床资料完整、彼此无血缘关系的IBD患者81例，男52例，女29例，诊断标准依据中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组制定的《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[2]。其中CD患者49例，年龄19～60岁，平均年龄(37.8±11.0)岁；UC患者32例，年龄18～80岁，平均年龄(44.6±15.3)岁。纳入同期健康体检者50名作为正常对照，男27名，女23名，年龄24～74岁，平均年龄(42.0±12.9)岁，三组间年龄和性别相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(见表1)。排除标准：合并其他自身免疫性疾病，近1个月未使用糖皮质激素治疗，近3个月未使用免疫抑制剂，无近期明确感染病史，无严重心、肺和神经、精神疾病，并除外糖尿病及其他内分泌疾病患者、肝肾功能损伤者、服用避孕药的女性育龄患者及创伤者等。

表1 IBD患者及健康对照者基本资料

Tab 1 Demographic characteristics of IBD patients and controls

CD组UC组正常对照组例数493250性别(男/女)33/1619/1327/23年龄(x±s,岁)37.8±11.044.6±15.342.0±12.9病史(x±s,年)6.3±2.65.6±3.2—年龄(A1/A2)33/1613/19—病变部位 L1/L2/L3/L4(CD)22/10/14/3—— E1/E2/E3(UC)—2/14/16—疾病行为 B1/B2/B319/20/10——肛周病变24/25——

注：A1:年龄<40岁，A2：年龄≥40岁。L1：末端回肠型，L2：结肠型，L3：回结肠型，L4：单纯累及上消化道型。E1：直肠炎，E2：左半结肠炎，E3：全结肠炎。B1：非狭窄非穿透型，B2：狭窄型，B3：穿透型。

1.2 试剂和仪器 dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、PvuⅡ限制性内切酶、100 bp DNA Ladder(Thermo Scientific，美国)，GelRed(Biotium，美国)，基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司DP348)，引物(上海生工合成)，离心器，PCR仪(Biometra，德国)，电泳槽，凝胶成像系统(BIO-RAD，美国)。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取：所有受试者采集EDTA抗凝静脉血2 ml，DNA抽提采用血液基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作，DNA样本置于-20 ℃保存备用。

1.3.2 引物的设计及合成：根据PRKCDBP基因的SNP位点(rs1051992)，设计相关的引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成，其上游序列为5′-GGCACTATCCTCTTCTCGCC-3′，下游序列为5′-TACCTTCTGCAATCCGGTGC-3′。

1.3.3 PCR反应：PCR反应体系内含10×PCR反应缓冲液2 μl、25 mmol/L MgCl20.8 μl、dNTP Mix (0.4 μl)、上下游引物各0.8 μl、Taq DNA聚合酶0.2 μl、模板DNA 200 ng(1 μl)，以灭菌三蒸水补足至20 μl。反应条件：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，57.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38个循环，72 ℃终延伸7 min。

1.3.4 基因型的判断: 取8 μl PCR产物、1 μl的PvuⅡ限制性内切酶及1 μl 10×Fast Digest Green Buffer混合，在37 ℃恒温水浴箱中放置25 min，在2%琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像仪中拍照观察结果。

1.3.5 PCR产物核苷酸序列测定： 随机选取野生型、杂合子、突变纯合子PCR产物各4例，由苏州金唯智有限公司进行序列测序。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行分析，组间基因型和等位基因频率的比较采用χ2检验，计算OR值和95%CI，并行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 CD组与正常对照组、UC组与正常对照组rs1051992 SNP位点基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。

2.2 PRKCDBP基因rs1051992 SNP位点在CD及UC患者与正常对照组基因型和等位基因频率分布 PRKCDBP基因rs1051992位点的PCR扩增产物位于391 bp(见图1)，酶切后电泳拍照CC纯合子表现为391 bp一条带，TT纯合子表现为304 bp、87 bp两条带，CT纯合子表现为391 bp、304 bp、87 bp 3条带(见图2)。基因测序结果示野生型为T，突变型为C，CC为蓝色单峰，CT为红色和蓝色重叠的套峰，TT为红色单峰(见图3～5)。CD组与正常对照组、UC组与正常对照组该位点基因型和等位基因频率相比，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

图1 PCR扩增目的基因片段; 图2 PRKCDBP基因T507C PCR-RFLP电泳结果 Fig 1 PCR amplification of the target genesegment; Fig 2 Result of electrophoresis of PRKCDBP gene T507C with PCR-RFLP

图3 纯合未突变(TT)；图4 纯合突变(CC)；图5 杂合突变(CT)Fig 3 No homozygous mutation (TT); Fig 4 Homozygous mutation (CC); Fig 5 Heterozygous mutation (CT)

表2 rs1051992位点在IBD患者及健康对照者中的基因型及等位基因频率分布

Tab 2 Genotypic and allelic frequencies of the rs1051992 polymorphism in IBD patients and controls

对照组[n(%)]CD组[n(%)]UC组[n(%)]对照vsCD组P值OR(95%CI)对照vsUC组P值OR(95%CI)TT8(16.0)4(8.2)4(12.5)0.0951.000.561.00CT19(38.0)29(59.2)16(50.0)3.050(0.805～11.569)1.684(0.427～6.642)CC23(46.0)16(32.6)12(37.5)1.391(0.357～5.417)1.043(0.260～4.183)T35(35.0)37(37.8)24(37.5)0.6870.888(0.497～1.585)0.7450.897(0.468～1.722)C65(65.0)61(62.2)40(62.5)

2.3 PRKCDBP基因rs1051992 SNP位点基因型和等位基因频率与IBD患者临床资料的关系 rs1051992位点在男性CD患者基因型分布与正常对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；CT基因型为男性CD患者发病的危险因素(OR=12.8，95%CI：2.095～78.597，P<0.05)；而男性UC患者未见差异；女性IBD患者基因型及等位基因分布与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表3～4)。rs1051992位点的基因型与CD及UC患者发病部位、疾病行为、有无肛周病变均无关(P>0.05)(见表5)。

表3 rs1051992位点在男性病例组及正常对照组中的基因型及等位基因频率分布

Tab 3 Genotypic and allelic frequencies of the rs1051992 polymorphism in male patients with IBD and controls

对照组[n(%)]CD组[n(%)]UC组[n(%)]对照vsCD组P值OR(95%CI)对照vsUC组P值OR(95%CI)TT7(25.9)2(6.1)1(5.3)0.0021.000.0531.00CT6(22.2)22(66.7)10(52.6)12.800(2.095～78.597)11.670(1.139～119.542)CC14(51.9)9(27.3)8(42.1)2.200(0.379～13.351)4.000(0.414～38.649)T20(37.0)26(39.4)12(31.6)0.7920.900(0.431～1.898)0.5881.275(0.529～3.070)C34(63.0)40(60.6)26(68.4)

表4 rs1051992位点在女性病例组及正常对照组中的基因型及等位基因频率分布

Tab 4 Genotypic and allelic frequencies of the rs1051992 polymorphism in female patients with IBD and controls

对照组[n(%)]CD组[n(%)]UC组[n(%)]对照vsCD组P值OR(95%CI)对照vsUC组P值OR(95%CI)TT1(4.3)2(12.5)3(23.1)0.6191.000.2621.00CT13(56.5)7(43.8)6(46.1)0.269(0.021～3.519)0.154(0.013～1.803)CC9(39.1)7(43.8)4(30.8)0.389(0.029～5.214)0.148(0.012～1.900)T15(32.6)11(34.4)12(46.2)0.8710.924(0.355～2.401)0.2540.565(0.210～1.515)C31(67.4)21(65.6)14(53.8)

表5 rs1051992位点的基因型与IBD患者临床特征的相关性

Tab 5 Association between rs1051992 genotypes and IBD patients’ clinical characteristics

TTCTCC(TT+CT)vsCCP值(CC+CT)vsTTP值L1/L2/L3/L4(CD)1/1/1/115/5/9/06/4/4/20.5700.311B1/B2/B3(CD)1/2/111/11/77/7/20.6281.000肛周病变(有/无)2/213/169/70.4780.931E1/E2/E3(UC)0/1/32/7/70/6/60.7420.696

3 讨论

IBD是一种复杂的多基因病，目前国内外研究已经发现多种基因为IBD的易感基因，PRKCDBP是一种肿瘤抑制蛋白，位于染色体11p15.5-15.4。最初，Izumi等[3]通过去血清法诱导蛋白激酶C结合蛋白的表达，并将其分离。Lee等[4]发现PRKCDBP可以通过加强P53蛋白的稳定性诱导细胞周期停滞及促进细胞凋亡。他们还发现PRKCDBP的转录是由于TNF-α通过NF-κB信号通路直接激活引起，作为TNF-α-NF-κB信号通路的转录目标，PRKCDBP在TNF-α诱导的凋亡过程中起关键作用，在肠癌患者也可见到其表达缺失或下降[5]。TNF-α是一个重要的促炎细胞因子，不仅在炎症过程中起作用，还涉及到凋亡、增殖及分化等过程[6]，参与结肠炎症及肿瘤的发生、发展。

Kim等[7]也发现UC患者结肠黏膜PRKCDBP的表达与TNF-α的表达高度相关，提示PRKCDBP在结肠的炎症发展过程中有一定的作用，其调节异常可能与IBD发病机制有关。目前已有数个研究报道了TNF-α基因与IBD发病的相关性，TNF-α及TNFSF1基因的启动子区的SNP与不同种族人群的遗传易感性均有关[8]。但PRKCDBP基因的SNP研究较少，目前在许多恶性肿瘤中发现染色体11p15存在等位基因的缺失，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌等[9]。我们有理由怀疑PRKCDBP可能成为IBD一个新的易感基因。

本研究选取PRKCDBP基因rs1051992位点研究中国汉族人群IBD的相关性，该位点为错义突变，T(野生型)突变为C(突变型)会导致其编码氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸，Kim等[1]发现韩国人群IBD患者该位点基因型频率及等位基因频率与健康对照组分布明显不同，具体表现为IBD患者CC基因型频率较正常对照组明显升高，TT及CT基因型频率未见明显差异。此外，UC患者C等位基因频率较正常对照组升高，且差异有统计学意义，而CD患者的C等位基因频率较正常对照组相比，差异无统计学意义。在我们的研究中，我们并没有发现CD及UC组与正常对照组在基因型及等位基因频率分布上有差异，进一步根据临床资料分析发现男性CD患者在基因型分布与正常对照组存在差异，CT基因型更易患CD，而等位基因频率与正常人相比，差异无统计学意义，UC患者在性别上未见明显差异，CD及UC患者该位点基因型与发病部位、疾病行为、有无肛周病变均无关。与Kim等[1]研究的结果不同，推测可能与我们研究样本量较小，或者存在种族、地域的差异有关。

本研究结果表明PRKCDBP基因多态性可能与中国汉族人群男性CD发病相关，结合国外研究结果，提示IBD易感基因多态性存在明显的地域、种族和病种差异。由于本研究纳入的样本量较小、地域较局限，因此还需进一步行多中心、大样本队列研究以最终明确该基因多态性与中国汉族人群IBD发病的相关性。

[1]Kim JW, Lee CK, Kim HJ, et al. Polymorphisms in PRKCDBP, a transcriptional target of TNF-α, are associated with inflammatory bowel disease in Korean [J]. Intest Res, 2015, 13(3): 242-249.

[2]中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组. 中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J].中华内科杂志, 2008, 47(1): 73-79. Inflammatory Bowel Disease Cooperation Group of Digestive Disease Association of Chinese Medical Association. Consensus of diagnosis and treatment standard in Chinese inflammatory bowel disease [J]. Chin J Intern Med, 2008, 47(1): 73-79.

[3]Izumi Y, Hirai S, Tamai Y, et al. A protein kinase Cdelta-binding protein SRBC whose expression is induced by serum starvation [J]. J Biol Chem, 1997, 272(11): 7381-7389.

[4]Lee JH, Byun DS, Lee MG, et al. Frequent epigenetic inactivation of hSRBC in gastric cancer and its implication in attenuated p53 response to stresses [J]. Int J Cancer, 2008, 122(7): 1573-1584.

[5]Lee JH, Kang MJ, Han HY, et al. Epigenetic alteration of PRKCDBP in colorectal cancers and its implication in tumor cell resistance to TNFα-induced apoptosis[J]. Clin Cancer Res,2011,17(24):7551-7562.

[6]Lee SH. Intestinal permeability regulation by tight junction: implication on inflammatory bowel diseases [J]. Intest Res, 2015, 13(1): 11-18.

[7]Kim JW, Kim HJ, Lee CK, et al. Elevation of PRKCDBP, a novel transcriptional target of TNF-α, and its downregulation by infliximab in patients with ulcerative colitis [J]. Dig Dis Sci, 2014, 59(12): 2947-2957.

[8]Thiebaut R, Kotti S, Jung C, et al. TNFSF15 polymorphisms are associated with susceptibility to inflammatory bowel disease in a new European cohort [J]. Am J Gastroenterol, 2009, 104(2): 384-391.

[9]Tong SY, Lee JM, Ki KD, et al. Genetic polymorphism of PRKCDBP is associated with an increased risk of endometrial cancer [J]. Cancer Invest, 2012, 30(9): 642-645.

(责任编辑：李 健)

Association between the polymorphism of PRKCDBP gene and inflammatory bowel disease in Chinese Han population

BAO Wenxia1, LI Ling1, TAO Lihua1, ZHANG Hailing1, PANG Zhi2

1.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006; 2.Department of Gastroenterology, Suzhou Municipal Hospital (North Branch), China

Objective To investigate whether the single nucleotide polymorphism (SNP) of PRKCDBP gene is associated with inflammatory bowel disease (IBD) in Chinese Han population.Methods Genomic DNA from 131 individuals of Chinese Han origin including 81 patients with IBD and 50 healthy controls were analyzed for the SNP (rs1051992) of the PRKCDBP gene. SNP rs1051992 was genotyped by restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction (RFLP-PCR) and verified by DNA sequence analysis.Results The genotypes and allelic frequencies at PRKCDBP SNP of rs1051992 of CD patients, UC patients and normal controls were in Hardy-Weinberg equilibrium. There were no significant differences in the genotypes and allelic frequencies among CD patients, UC patients and normal controls (P>0.05). Genotype-clicinal data analysis suggested that genotypes distribution of CD patients was associated with gender. The CT genotype increased the risk of male patients with CD (OR=12.8, 95%CI: 2.095-78.597，P<0.05). No significant difference was observed among disease location, disease behavior, perianal lesions of CD patients and gender, disease distribution of UC patients (P>0.05).Conclusion The polymorphism of PRKCDBP gene may be associated with male patients with CD in Chinese Han population.

Inflammatory bowel disease; PRKCDBP gene; Single nucleotide polymorphism; Han nationality

包文霞，在读硕士研究生，E-mail：20135232037@stu.suda.edu.cn

庞智，主任医师，硕士研究生导师，博士，研究方向：IBD的基础与临床治疗。E-mail：pangzhi0273@sina.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.07.010

R574.62

A

1006-5709(2016)07-0752-04

2015-10-26