断尾鼠精放置不同时间行ICSI对胚胎发育的影响

于成和，张若鹏，吴　睿，张丽蓉，朱　莉，董金玉，李　娟，阿周存（大理大学附属医院，云南大理　671000）



断尾鼠精放置不同时间行ICSI对胚胎发育的影响

于成和，张若鹏，吴睿，张丽蓉，朱莉，董金玉，李娟，阿周存*
（大理大学附属医院，云南大理671000）

［摘要］目的:鼠精断尾放置不同时间后注射入卵，评价其对胚胎发育潜能的影响。方法：实验分为10组：以立即注射为对照组，以分别放置0.5、1、2、3、4、5、6、12、24 h后注射为9个实验组，比较实验组与对照组有关原核形成率、2-细胞形成率、4-细胞形成率、桑葚胚形成率、囊胚形成率的差异。结果：放置6 h开始，原核形成率（68.4% vs. 82.5 %）、2-细胞形成率（83.3% vs. 96.0%）显著地低于对照组（P < 0.05）；放置4 h开始，4-细胞形成率（59.8% vs. 79.8 %）显著地低于对照组（P < 0.05）；放置2 h开始，桑葚胚形成率（47.9% vs. 67.7 %）显著地低于对照组（P < 0.05）；放置0.5 h开始，囊胚形成率（38.9% vs. 53.5%）显著地低于对照组（P < 0.05），1 h开始，囊胚形成率（17.0% vs. 53.5%）极显著地低于对照组（P < 0.01），放置3 h，无囊胚形成。结论：鼠精断尾放置一段时间后注射入卵，降低鼠胚发育潜能。

［关键词］断尾鼠精；不同时间；胚胎发育潜能

［DOI］10. 3969/j. issn. 1672-2345. 2016. 02. 005

卵泡浆内单精子注射技术（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI），是通过将单个精子直接注射到卵子胞浆内而使卵子受精的方法。1992年Palerml首次对人卵子进行ICSI操作，成功分娩了首例ICSI婴儿〔1〕。1996年，中山医科大学第一附属医院生殖中心通过ICSI技术为一对少精症不育夫妇助孕，成功分娩我国第一例ICSI婴儿，为我国ICSI行业做出突破性贡献。经过十几年的发展，ICSI己经成为一种不可缺少的治疗不孕不育技术，广泛应用于严重少弱精、梗阻性无精症、圆头（顶体缺乏）精子、常规IVF受精失败、死精子、冻融卵子、体外成熟卵子、种植前遗传学筛查、种植前遗传学诊断等治疗。随着技术的应用与发展，ICSI技术越来越广泛，全世界通过ART（辅助生殖技术）出生的孩子已经超过了400万〔2〕。

而由于伦理问题，许多ICSI方面的实验研究不能在人身上进行。因此，一些合适的动物模型为评估辅助生殖技术（ART）在胚胎发育和后代健康状况方面的潜在风险提供了重要的研究工具〔3〕。国内外众多学者对人、鼠、兔、马、羊、牛、猪和猴等进行ICSI，均得到正常后代〔4〕。由于小鼠的卵比人卵小很多且卵子细胞膜本身具有易脆性，小鼠精子和人的精子不同，小鼠精子头部呈勾形，尾部长且硬，用人类ICSI方法，达不到较好的效果。1995年，Kimu⁃ra等建立在通过Piezo产生的高频振动进行透明带穿刺及卵膜穿入的小鼠ICSI技术后，小鼠卵子存活率得以显著提高〔5〕。近年来，苗聪秀等对持卵管的改良而建立了一种新的小鼠ICSI技术，通过延伸穿刺凹陷深度显著提高卵子存活率〔6〕。一直以来，IC⁃SI是辅助生殖界的热点话题。在临床工作中，绝大部分工作者认可ICSI技术并广泛应用于实践工作中，但也有部分学者对其安全性持有怀疑态度。毕竟ICSI是一种被动授精方式，整个操作过程人为因素较多，不可避免地对卵子、精子造成损害。国内外众多学者对ICSI的受精率、优质胚胎率、临床妊娠率等相关因素进行大量研究，但从未报道过精子制动后随着放置时间延长，影响胚胎发育的情况。本实验是利用苗聪秀等人改良的小鼠ICSI新技术，精子实施断尾后，在体外PVP环境中放置不同时间，再注射入卵子，研究随时间的改变，对胚胎发育潜能的影响。本研究对提高ICSI胚胎质量及临床妊娠率提供理论依据，具有较高的临床应用价值。

1　材料与方法

1.1主要材料

1.1.1动物清洁级8～12周龄的昆明白雌雄鼠，购自大理大学动物房。

1.1.2主要药物、试剂、耗材、仪器孕马血清促性腺激素（杭州动物药品厂）、人绒毛膜促性腺激素（杭州动物药品厂）、MHTF（AIM）、CZB培养液（Sigma）、PVP（IS）、SSS（IS）、透明质酸酶（SIGMA）、Falcon3001、Falcon3037、Falcon3037、巴德斯管、拉针仪、断针仪、Olympus倒置显微镜及操作系统等。

1.2方法

1.2.1注射针和持卵管的制备

1.2.1.1注射针用于人卵的尖口显微注射针（Humagen）。

1.2.1.2持卵管制作过程参见相关文献〔7〕，具体如下：将G-100型玻璃毛细管通过拉针仪加热，手动拉长、拉细局部毛细管管壁，使管径为50～70 μm的部分较长，置于烧针仪上，在内径约为60 μm处加热，使其收缩并变弯至约25°，转动毛细管180°，使对侧被加热收缩并变直，再转动90°，重复上述加热过程，使得该处管壁内径均匀收缩至约15 μm，在该处向末端方向55～60 μm内径处，用烧针仪拉断并加热使断口钝化，在近末端约500 μm处加热使其弯曲至约35°，开口为喇叭形状的末端内径为45～55 μm的持卵管制作完成。

1.2.2卵母细胞的准备参见曾明有关文献〔8〕并结合本实验情况，具体如下：对70小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）（10 IU/只），48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）（10 IU/只），12.5～ 14 h后颈椎脱臼法处死小鼠，取出卵巢和子宫双侧输卵管，置于37℃预热的体外操作液MHTF中，解剖镜下撕开输卵管的壶腹部（膨大、透亮）并剥开卵巢上较大的卵泡，找到卵丘复合体，转移至装卵皿中并计数，共获取1 503个卵丘复合体，用巴斯德管将卵丘复合体吸到37℃预热含透明质酸酶液的体外操作液MHTF（按3：10的体积比，酶消化l min）中反复吹打分散卵丘复合体，并转移至不含透明质酸酶的37℃预热操作液MHTF中，用口径更小的拆蛋针反复吹打以除尽卵子周围的颗粒细胞，获取1 487个去颗粒细胞的卵母细胞，转移到生长皿中待注射。

1.2.3精子的准备参见曾明有关文献〔8〕并结合本实验情况，颈椎脱臼法处死3～6月龄的性成熟公鼠，取其双侧附睾尾（连着输精小管）置于体外操作液，解剖显微镜下从附睾尾端开始挤出输精小管中的精子团，将精子团置于装有1 mL体外操作液MHTF的圆底小管底部，37℃恒温上游15 min吸取上游液于新管中备用。

1.2.4ICSI程序

1.2.4.1上针，配注射盘先上持卵管，再上注射针，调节持卵管和注射针的平面。根据卵子多少，用MHTF液制若干滴，中央加入PVP，迅速覆盖油，使液面全部覆盖。

1.2.4.2分组及ICSI操作

1.2.4.2.1分组丢弃17个形态异常的卵母细胞，随机将1 470个卵子平均为10组。分别放入已标记的注射盘内的注射滴中（1枚/滴），将精子吸入边缘长形液滴中。以精子断尾后立即注射为对照组，以精子断尾放置0.5 h注射为实验1组，以精子断尾放置1 h注射为实验2组，以精子断尾放置2 h注射为实验3组，以精子断尾放置3 h注射为实验4组，以精子断尾放置4 h注射为实验5组，以精子断尾放置5 h注射为实验6组，以精子断尾放置6 h注射为实验7组，以精子断尾放置12 h注射为实验8组，以精子断尾放置24 h注射为实验9组。

1.2.4.2.2ICSI操作根据每组ICSI时间安排卵子准备时间，每组卵子准备结束后，用注射针挑选活力好、形态正常的精子，压住颈部，朝精子头的方向刮动，即可从颈部将精子头拉断。将断尾的精子头部吸入显微注射针内，转动卵子使得纺锤体区处于6或12点钟位置，在其9点钟位置用新制作持卵管将卵子固定，将精子推至注射针尖口，从卵子的3点钟方向插入卵子，先浅吸持后浅穿刺，再进一步深吸持并深穿刺，插入深度约90 μm，抽吸胞质至观察到胞质流动突然加剧而提示胞膜破裂时，停止抽吸并以正压将精子头注入卵胞质内再以轻微的负压小心抽出显微注射针，持卵管释放卵子。精子断尾由专人完成并计时，注射卵子由3名技术娴熟实验室人员完成。

1.2.5胚胎培养与观察参见曾明有关文献〔8〕，IC⁃SI操作结束后，在CZB培养液滴中洗涤2～3次后转换至与标记相对应的CZB生长皿中，置于37℃、5.0% CO2箱培养，ICSI（当天记为D0.5）后7 h观察受精及卵子的存活情况（有变黑、漏浆等特征判为死亡），ICSI后次日中午（记为Dl.5）观察受精卵是否卵裂及胚胎情况，ICSI后第3天中午（记为D3.5）观察桑甚胚情况，ICSI后第4天中午（记为D4.5）观察囊胚情况。

1.2.6统计分析应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，采用精确概率法的双侧χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

总MⅡ率、总卵子存活率分别为87.2%（1 282/ 1 470）、90.0%（1 154/1 282）。对照组原核出现率、2-细胞形成率、4-细胞形成率、桑葚胚形成率、囊胚形成率分别为82.5%、96.0%、79.8%、67.7%、53.5%，提示卵子质量及技术操作正常。各实验组与对照组比较，精子断尾后放置6 h及以上组，原核出现率、2-细胞形成率显著性降低（P<0.05）；放置4 h及以上组，4-细胞形成率显著性降低（P<0.05）；放置2 h及以上组，桑葚胚形成率显著性降低（P<0.05）；放置0.5 h及以上组，囊胚形成率显著性降低（P<0.05），放置3 h，无囊胚形成，见表1。

表1　精子断尾放置不同时间后注射卵子存活、受精及胚胎发育的比较

3　讨论

ICSI技术虽已在临床治疗中得到广泛影响，但仍有很多问题待研究，特别是ICSI特有的过程，例如精子制动对精子、卵子及胚胎发育的影响，外界环境对制动后的精子影响，PVP对胚胎发育潜能的影响等。

对于试管婴儿来说，胚胎发育潜能极其重要。影响ICSI胚胎潜能的因素很多，例如精子因素、技术操作、卵子因素、体外环境等。在精子因素上，虽然ICSI对精子的要求几乎没有限制：活精子、死精子、不运动的精子、附睾精子和睾丸精子都可被用于ICSI操作〔9〕。但临床工作中，不同来源的精子对胚胎质量的影响不同。实验采用“改良的非Piezo依赖的小鼠ICSI新技术”解决卵子胞膜脆性等问题，通过断尾解决精子尾部长等问题，科室实验室技术人员操作技术均娴熟且随机参与到每组实验中，减低人员之间的误差，保证数据的可靠性。此外，促排卵药物及外界温度、湿度、光线均可影响胚胎发育潜能，这些因素对实验组和对照组的影响等同并实验数据结果可靠，故不考虑其影响。

研究结果表明，随着精子断尾后在PVP停留时间延长，对原核形成率、正常卵裂率、桑葚胚形成率、囊胚形成率的影响逐步显著，与Kaoruko Mizuno报道〔10〕类似。在评价体系上，胚胎发育越到后期，越能反应胚胎发育的潜能，放置0.5 h后，囊胚形成率显著性降低，放置1 h极显著性降低，并与0.5 h组相比较显著性降低（P < 0.05），放置3 h，无囊胚形成。鼠精断尾后，放置在外界环境中，导致其内部结构和功能的改变，可能与染色体降解或中心粒失活有关。因此在ICSI临床工作中，精子制动后，应尽快注射入卵，减少精子的损伤，保障胚胎发育潜能。

［参考文献］

〔1〕PALERMO G，JORI H，DEVROEY P，et al. Pregnancies af⁃ter intracytoplasmic injection of single spermatozoom into an oocyte〔J〕. The Lancet，1992，340（8810）：17-18.

〔2〕王巍，马海兰.人类辅助生育技术的应用现状〔J〕.右江民族医学院学报，2011，3（3）：335-337.

〔3〕唐娜，王晓红，梁新新，等. ICSI导致小鼠胚胎雄原核H3K9甲基化异常以及胚胎发育迟缓〔J〕.中华男科学杂志，2013，19（7）：593-598.

〔4〕YANAGIMACHI R. Gamete manipulation for development：new methods for conception〔J〕. Reprod Fertile Dev，2001，13（1）：3-14.

〔5〕KIMURA Y，YANAGIMACHI R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse〔J〕. Biol Reprod，1995，52（4）：709-720.

〔6〕苗聪秀，燕志光，杨红梅，等.一种非Piezo依赖的高卵子存活率小鼠显微授精技术〔J〕.上海交通大学学报（医学版），2012，32（8）：1020-1023.

〔7〕LYU Q F，DENG L，XUE S G et al. New technique for mouse oocyte injection via a modified holding pipette〔J〕. Reprod Biomed Online，2010，21（5）：587-588.

〔8〕曾明.小鼠ICSI新技术及其用于提高人类辅助生殖技术的研究〔D〕.南昌：南昌大学，2011.

〔9〕严阿勇，李明，安晓荣，等.胞浆内精子注射技术生产小鼠〔J〕.生物工程学报，2005，21（2）：305-309.

〔10〕KAORUKO M，KAZUHIKO H，THOMAS H. Fertilization and embryo development in a mouse ICSI model using human and mouse sperm after immobilization in polyvinyl⁃pyrrolidone〔J〕. Human Reproduction，2002，17（9）：2350-2355.

（责任编辑董杰）

Effect of Different Standing Time of Mouse Docking Sperm in ICSI on Mouse Embryonic Development

Yu Chenghe, Zhang Ruopeng, Wu Rui, Zhang Lirong, Zhu Li, Dong Jinyu, Li Juan, A Zhoucun*
（Affiliated Hospital of Dali University, Dali, Yunnan 671000, China）

〔Abstract〕Objective: To evaluate the effect of different standing time of mouse docking sperm in intracytoplasmic sperm injection （ICSI）on embryo development potential. Methods: Ten groups were divided by docking sperm standing time（0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24 h）. The rates of pronucleus formation, 2-cell formation, 4-cell formation, morulation and blastocysts formation were compared between each experimental group and the control group. Results: The pronucleus formation rate（68.4% vs. 82.5%）, and the 2-cells formation rate（83.3% vs. 96.0%）were significantly lower in the standing 6 h group than those in the control group（P<0.05）. The 4-cells formation rate（59.8% vs. 79.8%）was significantly lower in the standing 4 h group than that in the control group（P<0.05）. Morulation rate（47.9% vs. 67.7%）was significantly lower in the groups with standing 2 h group than that in the control group（P< 0.05）. The average blastocyst formation rate（38.9% vs. 53.5%）was significantly lower in all standing groups than that in the control group（P<0.05）. The Blastocyst formation rate dropped significantly as the standing time extension. No blastocyst was observed when standing time longer than 3 h. Conclusion: Delay of mouse docking sperm ICSI reduced the development potential of mouse embryo.

〔Key words〕docking sperm; different time; embryo development potential

［中图分类号］R321.1

［文献标志码］A

［文章编号］1672-2345（2016）02-0019-04

［基金项目］大理学院青年教师科研基金资助项目（KYQN201316）

［收稿日期］2015-05-11［修回日期］2015-07-01

［作者简介］于成和，检验师，主要从事生殖医学与实验室技术研究.

*通信作者：阿周存，教授.