尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物修复兔尿道缺损的实验研究*

林阳彦王 沫杨 勇邱春明欧群雄何 佩李炳坤. 佛山市南海区第三人民医院泌尿外科（广东佛山　5844）；. 南方医科大学珠江医院泌尿外科



尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物修复兔尿道缺损的实验研究*

林阳彦1王 沫1杨 勇1邱春明1欧群雄1何 佩1李炳坤2
1. 佛山市南海区第三人民医院泌尿外科（广东佛山258244）；2. 南方医科大学珠江医院泌尿外科

摘要目的 探索用尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物修补长段尿道缺损的可行性及效果。方法 取雄性新西兰兔（2.5kg）27只，随机分成3组： 实验组：尿道上皮细胞/多孔丝素蛋白支架复合物组（n＝9）；对照组Ⅰ：假手术组（n＝9）；对照组Ⅱ：尿道缺损组（n＝9）。三组共同饲养4周和16周后，分别对手术部位行病理学检查，8周后分别进行膀胱尿道造影、尿动力检测（尿道测压）和病理检测。结果 27只兔实验过程中无一例死亡。对照组Ⅰ术后4、8及16周，尿道组织结构无明显区别，尿道上皮细胞均匀覆盖，层数约4～5层，排列规则，未见炎症细胞。对照组Ⅱ术后4、8及16周瘢痕形成，组织质地坚韧，腔壁纤维化形成，可见大量的纤维组织及成纤维细胞，黏膜缺损；实验组术后4周时可见较多炎症细胞，材料表面细胞黏附，层数约6～8层，丝素蛋白复合体发生扭曲，术后8周片状多孔丝素蛋白支架降解成碎片状，组织均匀覆盖；术后16周尿道上皮细胞排列均匀，层数约4～5层，无明显炎症细胞浸润，可见较多血管，与对照组Ⅰ相似。术后8周，对照组I膀胱尿道造影显示尿道黏膜连续性好，管腔光滑，管径均匀。对照组Ⅱ造影片显示尿道黏膜连续性的中断，管腔毛糙，尿道管径变细，呈现尿道狭窄的表现。实验组膀胱尿道造影提示尿道黏膜的连续性良好，管腔稍毛糙，管径与对照组I基本一致。尿道测压：实验组术后8周手术部位的尿道阻力平均值（15.25±1.72）cmH2O，对照组I尿道阻力的平均值为（14.85±1.96）cmH2O，两组对比无统计学差异（P＞0.05），对照组II尿道阻力平均值为（27.83±3.71）cmH2O，阻力明显增高，与实验组及对照组Ⅰ相比均有明显的统计学差异（P＜0.05）。结论 尿道上皮细胞/多孔丝素蛋白支架复合物可以作为尿道修复的支架，具有促进尿道缺损修复的能力。

关键词组织工程； 尿道狭窄；丝素蛋白质类；上皮细胞

尿道狭窄是泌尿外科的常见病，但是目前尿道狭窄的治疗仍然是泌尿外科医生的巨大挑战，尤其是＞3cm的长段狭窄，目前的常用的修补方法，再狭窄率仍然很高，所以目前泌尿外科的学者们都在寻求价廉物美、效果良好、并发症少的尿道修补材料。丝素蛋白是目前组织工程学的一种重要材料，其无毒性、无刺激作用，组织相容性好，同时来源丰富，价格低廉，具有巨大的潜力和优势，目前已尝试应用于多种组织修补，本文尝试应用尿道上皮细胞/多孔丝素蛋白支架复合物修补尿道，以明确尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物修补长段尿道缺损的可行性及效果。

材料与方法

一、材料

雄性新西兰兔27 只（2.5±0.5）kg （南方医科大学动物实验中心） 丝素蛋白支架孔径80μm。

二、尿道上皮细胞/多孔丝素蛋白支架复合物的制备

1. 用 75%酒精溶液的浸泡消毒多孔丝素蛋白支架，取出后干燥24h。

2. 将丝素蛋白支架置于环氧乙烷气体中灭菌12h。

3. 将丝素蛋白支架修剪为1.5cm×1.0cm，用含10%胎牛血清的DMEM培养基浸泡24h后，将支架材料转移到细胞培养板孔内。

4. 将原代分离的兔尿道上皮细胞传代3次后加入至放置有支架材料的24孔板内，每孔加入1mL，注意要使支架材料浸没在培养基中。

5. 将支架材料在37℃、5% CO2培养箱内培养24h，取出，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，在37℃、5% CO2培养箱内培养48h。

三、动物分组

27只兔随机分成3 组：实验组（9只）； 对照组Ⅰ（9只）； 对照组Ⅱ（9只）。

四、方法

（一）手术方法

1. 实验组切开兔阴茎皮肤及皮下组织 游离出尿道海绵体，切开尿道海绵体，将尿道黏膜切除1.5 cm，用1.5 cm 尿道上皮细胞/多孔丝素蛋白支架复合物修复尿道缺损，以7-0 肠线缝合两端两吻合口分别选取3点、 9点及12点，以5-0 丝线作为标记，术后留置8F 导尿管1周后拔除。

2. 对照组Ⅰ行尿道海绵体切开后，即逐层缝合海绵体、皮下组织及皮肤，术后留置8F 导尿管，1周后拔除。

3. 对照组Ⅱ操作同实验组，切除尿道中段1.5cm尿道黏膜，逐层缝合切口，依靠尿道自体组织再生修复缺损，术后留置8F 导尿管，1周后拔除。

（二）检测方法

1. 对3组实验兔分别在戊巴比妥钠静脉麻醉下进行尿动力学检测（尿道测压）。

2. 对3组组织增生情况观察及逆行尿道造影 在术后8 周行逆行尿道造影，然后取材行HE 染色、Van Gieson VG染色及免疫组织化学染色观察组织再生情况。

结　果

27只兔实验过程中无一例死亡。术后8周，对照组Ⅱ造影片显示尿道黏膜连续性中断，管腔毛糙，尿道管径变细，呈现尿道狭窄的表现。对照组Ⅰ膀胱尿道造影显示尿道黏膜连续性好，管腔光滑，管径均匀。实验组膀胱尿道造影提示尿道黏膜的连续性良好，管腔稍毛糙，管径与对照组Ⅰ基本一致（图1）。

对照组Ⅰ术后4、8及16周尿道组织结构无明显区别，尿道上皮细胞均匀覆盖，层数约4～5层，排列规则，未见炎症细胞，黏膜下可见较多的平滑肌细胞，间有少量胶原纤维；VG染色可见胶原纤维呈鲜红色，数量较少，平滑肌细胞呈黄色，胶原纤维分散分布于平滑肌之间（图2）。对照组Ⅱ术后4及8周时均见腔壁纤维化形成，可见大量的纤维组织及成纤维细胞，其间可见炎症细胞，大部分区域上皮细胞缺失，少数区域可见少量上皮细胞，排列混乱；16周仍以纤维组织为主，瘢痕化形成，可见陈旧性纤维组织，上皮细胞增多，层数约4～5层，排列混乱，偶可见少量平滑肌细胞，VG染色示修复区大量胶原纤维（图3）。

图11　AA、BB、CC 分别是对照组Ⅰ、对照组Ⅱ及实验组术后8周逆行尿道造影对照组I尿道黏膜连续性好，官腔光滑，对照组II尿道黏膜连续性中断，官腔毛糙，实验组尿道黏膜连续性好，管腔稍毛糙

图22　AA、BB分别是对照组Ⅰ术后1166周尿道组织切片HHEE染色和VVGG染色（×400）尿道组织结构无明显区别，尿道上皮细胞均匀覆盖，层数约4～5层，排列规则，未见炎症细胞

图33　A、BB、CC、DD 分别是对照组Ⅱ术后8周、1166周尿道组织切片HHEE染色和术后8周、1166周VVGG尿道组织切片染色（×200）4及8周时均见壁纤维化形成，可见大量的纤维组织及成纤维细胞，其间可见炎症细胞，大部分区域上皮细胞缺失，16周仍以纤组织为主，瘢痕化形成，可见陈旧性纤维组织

实验组术后4周时可见较多炎症细胞，材料表面细胞黏附，层数约6～8层，排列不均匀，丝素蛋白支架网状结构进一步发生扭曲，可见部分网状结构裂解；8周时镜下难于辨认丝素蛋白膜支架，表面细胞层数约5～7层，排列较4周时均匀，渐趋向规则，炎症细胞较前明显减少，可见较多的成纤维细胞及胶原纤维，排列不规则，同时可见少量的平滑肌细胞及小口径血管；16周尿道上皮细胞排列均匀，完全覆盖，层数约4～5层，平滑肌细胞明显增多，成纤维细胞及胶原纤维数量减少、排列规则，无明显炎症细胞浸润，可见较多管径粗大的血管，与对照组Ⅰ相似（图44，图5）。

尿道测压：实验组术后8周手术部位的尿道阻力平均值（15.25±1.72）cmH2O，对照组I尿道阻力的平均值为（14.85±1.96）cmH2O，两组对比无统计学差异（P＞0.05）；对照组Ⅱ尿道阻力平均值为（27.83±3.71）cmH2O，阻力明显增高，与实验组及对照组Ⅰ相比均有明显的统计学差异（P＜0.05）。

图44 AA、BB、CC 分别是实验组术后4、88、1166周尿道组织切片HHEE染色（×400）丝素蛋白支架逐渐吸收，表面细胞逐渐增多，细胞层数逐渐增至4～5层，排列整齐，滑肌细胞明显增多，成纤维细胞及胶原纤维数量逐渐减少

图55　AA、BB实验组术后8周及1166周实验组尿道组织切片VVGG染色（×400）丝素蛋白支架消失，表面细胞逐渐增多，细胞层数逐渐增至4～5层，排列整齐，滑肌细胞明显增多，成纤维细胞及胶原纤维数量逐渐减少，可见较多管径粗大的血管

讨　论

尿道狭窄（urethral strictures，US）是临床泌尿外科较为常见的一类疾病， 对于泌尿外科医生来说，尿道狭窄仍然是一个重大的挑战，尤其是对超过3cm的长段尿道狭窄，目前临床常用的治疗方法效果均不甚理想［1］。对于长段的尿道狭窄，目前主要的治疗方法是替代材料尿道成形术，所面临的主要问题就是寻找替代材料。过去10多年，临床上的替代材料从自体皮肤黏膜、膀胱黏膜、口腔黏膜到移植物［2］。对于自身材料，这些方法均以牺牲自体正常组织为代价，造成额外的创伤，一旦效果不好，造成双重损失。另外，有学者尝试应用程序化冻存同种异体膀胱黏膜作为修补材料，但仅限于实验阶段［3，4］。而组织工程材料为长段尿道缺损带来的新的希望，但是大多数组织工程材料价格相对昂贵，限制了其广泛应用。

丝素蛋白以组织相容性好，理化特性稳定，在体内可降解等优势作为组织工程学良好的支架材料得到大家的肯定。另外，丝素蛋白是由蚕茧缫丝脱胶而得的纤维状蛋白质，所以来源丰富［5，6］。随着制备技术的进步，制备丝素蛋白的成本也越来越低，所以丝素蛋白有可能成为被广泛应用的尿道修补材料。

我们的前期实验，尝试用单纯多孔丝素蛋白支架修复1.5cm的新西兰大白兔尿道缺损，术后8周，尿道上皮细胞和平滑肌细胞逐渐修复尿道缺损区，术后16周，尿道上皮细胞和平滑肌细胞排列有序，与正常对照组无明显差异［7］。但是，有报道认为，由于丝素蛋白的吸收速度问题，在尿道完全修复前，丝素蛋白已经吸收，会导致修复段尿道的挛缩；而应用细胞支架复合物修复尿道，尽管相对复杂，并且周期较长；但由于存在尿道上皮种子细胞的再生作用，修复较快，能够有效缩短尿道修复时间，降低修复段尿道的挛缩发生率。所以理论上说，细胞/支架复合物要比单纯支架修复缺损的尿道效果更好。至于多孔丝素蛋白的孔径多大为最优，目前也在探索阶段。

本实验尝试应用80μm的尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物修复1.5cm的新西兰大白兔尿道缺损，实验结果表明，术后无论是影像学的尿道通畅程度，还是尿动力学的尿道压力，均与正常对照无明显差异。初步说明应用尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物作为长段尿道缺损的修补替代材料，是有效的。但是本实验也存在一定局限性，包括随访时间较短而且仅仅应用于新西兰大白兔，所以，应用于需要进一步的实验进行验证。今后我们进一步实验将尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物应用于较大的动物，比如比格犬等动物。另外，尝试应用于不同长度的尿道狭窄的修补，证实其适合修复的尿道长度。最后，需要延长实验时间，明确其长期疗效。

参 考 文 献

1 Peterson AC， Webster GD. Management of urethral stricture disease： developing options for surgical intervention. BJU Int 2004； 94（7）： 971-976

2 Singh O， Gupta SS， Arvind NK. Anterior urethral strictures： a brief review of the current surgical treatment. Urol Int 2011； 86（1）： 1-10

3 Lu Y， Li B， Wang X， et al. The effect of programmed cryopreservation on immunogenicity of bladder mucosa in New Zealand rabbits. Cryobiology 2012； 64（1）： 27-32

4 Li B， Lu Y， Liu C， et al. Urethral reconstruction using allogenic frozen-thawed bladder mucosa： an experimental study. Urol Int. 2013； 90（4）： 422-429

5 Altman GH， Diaz F， Jakuba C， et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 2003； 24（3）： 401-416

6 Dal Pra I， Freddi G， Minic J， et al. De novo engineering of reticular connective tissue in vivo by silk fibroin nonwoven materials. Biomaterials. 2005； 26（14）： 1987-1999

7 刘春晓， 林阳彦， 李虎林， 等. 丝素蛋白膜修复兔尿道缺损的实验研究. 南方医科大学学报 2007； 27（2）： 184-187

（2016-01-08收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.003

中图分类号R 695.4

*基金项目资助：2013年广东省自然科学基金项目（S2013040016823）；2014年度佛山市卫生局医学科研立项（2014293）

Application of urethral epithelial cells/Silk Fibroin composite in rabbit urethral defect repairing*

Lin Yangyan1， Wang Mo1， Yang Yong1， Qiu Chunming1， Ou Qunxiong1， He Pei1， Li Bingkun2
1. Department of Urology， the Third People's Hospital of Nanhai District， Foshan 258244， Guangdong， China 2. Department of Urology， Zhujiang Hospital， Southern Medical University

AbstractObjectiveTo explore the feasibility and effect of urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite in long-segment urethral defect repairing. Metthhooddss Total of 27 male New Zealand rabbits （2.5Kg） were randomly divided into 3 groups such as the experimental group （urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite group， n=9）； the control group I （sham-operated group， n=9）； the control group Ⅱ （Urethral defect group， n=9）. Pathology was performed in three groups after 4 and 16 weeks feeding. Cystourethrography， urodynamics （urethral pressure） and pathology were detected after 8 weeks feeding. RessuullttssNo rabbit died during the experiment. In 4， 8 and 16 weeks after operation， the urethral organization of control groupⅠhad no obvious difference， about 4～5 layers urethral epitheliums covered uniformly andregularly. There was no infl ammatory cell. In the control groupⅡ， scar tissue was formed， a large amount of fi brous tissue and mucosa defect was showed in the urethra. In 4 weeks after the operation， there were lots of infl ammatory cells， about 6～8 layers of cells were adhered on the material， and urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite were distorted. In 8 weeks after the operation， urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite degraded into chips and uniform tissue was cover on the urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite； In 16 weeks after the operation， urethral epithelial cells arranged in uniform layers， about 4～5 layers， no obvious infl ammatory cells infi ltered， there were lots of blood vessels，similar to the control group I. The cystourethrography of the control group Ⅱ showed the interruption of urethral mucosa，narrowing of the urethral lumen. The cystourethrography of the control group I revealed good continuity of urethral lumen. The cystourethrography of experimental group was similar to the control group I. Urethral pressure-the urethral resistance 8 weeks after the operation： the average urethral pressure of experimental group was （15.25±1.72） cm H2O， and the control group I was （14.85±1.96） cm H2O， no signifi cant difference was found between two groups （P＞0.05）. The average urethral pressure of control group II was （27.83±3.71）cm H2O， a signifi cant difference was found compared with the experimental group and the control group I （P＜0.05）. ConclussiioonnUrethral epithelial cells / porous silk fi broin composite can be used as scaffold for urethral repair， and have the ability to promote the urethral defect repair.

Key wordstissue engineering；urethral stricture；fi broins；epithelial cells