人前列腺癌PC-3细胞系再表达雄激素受体对生长因子相关基因族表达的影响*

曹靖晨张 冲王海燕张永辉陈苗苗吕秀芳鄂 群， 2刘 欣江 明**. 南通大学医学院基础医学研究室核受体与肿瘤研究实验室（南通　22600）；2. 南通大学医学院病理学系；. 江苏省靖江市人民医院泌尿外科



·论著·

人前列腺癌PC-3细胞系再表达雄激素受体对生长因子相关基因族表达的影响*

曹靖晨1张 冲1王海燕1张永辉1陈苗苗1吕秀芳1鄂 群1， 2刘 欣3江 明1**
1. 南通大学医学院基础医学研究室核受体与肿瘤研究实验室（南通226001）；2. 南通大学医学院病理学系；3. 江苏省靖江市人民医院泌尿外科

摘要目的研究雄激素受体（AR）阴性人前列腺癌PC-3细胞系再表达人全长 AR cDNA，即PC-3-AR+细胞系生长因子相关基因族的表达情况，探讨雄激素依赖型和非依赖型前列腺癌细胞AR与生长因子信号途径的相关性。方法采用PCR芯片技术（PCR-array）进行研究，利用德国Qiagen公司的RT² Profiler™ PCR Array Human Growth Factors板对PC-3、PC-3-AR+两株细胞系的生长因子相关基因族的表达量进行相对定量分析，之后通过数据分析，比较基因表达的差异。结果两株人前列腺癌细胞系PC-3和PC-3-AR+中生长因子相关基因族的表达有明显差异性， 其中FGF13、IGF2、CSF2、CXCL1等基因表达差异倍数超过5倍以上，具有显著性差异（P＜0.01）。结论人前列腺癌细胞系PC-3再表达雄激素受体AR影响其生长因子相关基因族的表达，人前列腺癌AR与生长因子表达信号通路具有相关性。

关键词前列腺肿瘤；受体， 雄激素；生长因子

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是欧美国家最常见的男性泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，其致死率在美国仅次于肺癌［1， 2］。中国前列腺癌的发病率远低于欧美国家，但近几年来，由于环境污染、饮食结构西方化及人口老龄化等因素，前列腺癌的发病率有明显的上升趋势［3］。

常见的前列腺癌治疗方法主要包括手术、放疗、化疗和性激素内分泌疗法等，这些治疗方法虽有一定的效果，但并没有给进展期前列腺癌患者带来很好的生存利益［3］。尽管如此，以雄激素受体（androgen receptor，AR）信号轴为治疗靶点的雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy， ADT）依然是前列腺癌的一线治疗方法［4， 5］。在经过2～3年的ADT后，大部分患者将逐渐进展为去势抵抗性前列腺癌（castration resistance prostate cancer， CRPC），CRPC患者中位生存期往往小于20个月，对于这部分患者的治疗方法十分有限，且预后差［6］。目前对于CRPC的发生发展机制尚不十分明确，但可以确定的是雄激素及其受体AR功能的改变在其中发挥着重要作用。我们已完成的研究表明，AR在人前列腺癌细胞中再表达可以使得癌细胞生长能力减弱，增殖和迁移能力受抑制；可以降低体内移植瘤的成瘤率、成瘤体积和浸润能力等［7］。

生长因子是具有刺激细胞生长活性的细胞因子。前列腺是具有内、外双重分泌功能的性分泌腺。正常前列腺组织可以通过自分泌或旁分泌调控生长因子的表达和分泌，从而间接调控细胞的生长发育。近年来，相当一部分前列腺癌研究都集中在生长因子相关信号通路上［8-10］。

本研究旨在应用PCR芯片技术（PCR-array），对比性研究人全长雄激素受体AR cDNA再表达人前列腺癌细胞系PC-3-AR+与AR阴性的人前列腺癌细胞系PC-3中生长因子相关基因族的表达差异，探讨前列腺癌AR的表达与生长因子信号通路的相关性，为进一步研究生长因子相关基因表达谱的变化及其与肿瘤生物学特性的关系，为临床预防和治疗前列腺癌，特别是去势抵抗性前列腺癌提供前期实验资料。

材料与方法

一、实验材料

（一）细胞系

人前列腺癌细胞系PC-3，购自美国ATCC（美国模式培养物集存库），该细胞系不具有可检测的雄激素敏感性，为雄激素非依赖型细胞。人雄激素受体（AR）全长cDNA质粒（pSAR-IRES-EGFP）稳定转染建立的AR再表达人前列腺癌细胞系PC-3-AR+，由美国John Hopkins大学医学院John T. Isaacs教授赠送［11］。

（二）主要试剂

RPMI-1640培养基、0.25%胰酶消化液、双抗，美国Hyclone公司；胎牛血清，美国Gibco公司；蛋白裂解液、上样缓冲液、脱脂奶粉，碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，美国Thermo Scientifi c Pierce公司；AR抗体（sc-816），美国Santa Cruz公司；β-actin抗体（A5316），美国Sigma-Aldrich公司；ECL化学发光显影剂，美国Thermo Pierce公司；Trizol，美国Thermo Fisher Scientific公司； RNeasy Mini Kit（74104）、RT2 First Strand试剂盒（330401）、RT² SYBR Green ROX qPCR Mastermix（330522）、RT2 Profi ler PCR Array Human Growth Factors（PAHS-041Z），德国Qiagen公司。

二、仪器

CO2培养箱（美国Thermo Fisher），酶标仪（瑞士TECAN，M200），倒置相差显微镜（德国Leica），电泳仪（美国Bio-Rad，PowerPac Basic），化学发光成像系统（美国Bio-Rad，ChemiDoc XRS+），Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific），NanoDrop2000分光光度计（美国Thermo Fisher）。

三、实验方法

（一）细胞培养

人前列腺癌细胞系PC-3和PC-3-AR+用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液置于37℃、5% CO2、饱和湿度恒温培养箱培养，0.25%胰酶消化传代。

（二）PCR芯片（PCR-array）技术

1. RNA的制备：PC-3细胞和PC-3-AR+细胞培养于T25培养瓶，各3瓶，细胞生长至80%时，Trizol提取细胞总RNA，按Qiagen Rneasy Mini Kit说明步骤对总RNA进行纯化。加入TE Buffer溶解后，用NanoDrop2000紫外分光光度计进行吸光度的测量。

2. RNA琼脂糖凝胶电泳质控：用0.5×TAE电泳缓冲液制作1%琼脂糖凝胶，加0.5×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。用移液器吸取总RNA样品4μL，0.5×TAE电泳缓冲液5μL，0.5μg/mL溴化乙锭（EB）10×载样缓冲液，混匀后上样。调节电压至100V进行电泳，约30min后停止电泳，化学发光仪观察RNA电泳结果。

3. 逆转录反应-cDNA的合成：首先按RT2First Strand试剂盒说明步骤进行基因组DNA去除反应，取总质量1μg的总RNA，反应液GE 2μL，无RNA酶纯净水，构建基因组DNA去除反应体系10μL，42℃保温5min，接着放在冰上至少1min。然后按RT2First Strand试剂盒说明步骤进行逆转录反应， 5×反应液BC3 4μL，P2 1μL，RE3逆转录酶混合液2μL，无RNA酶纯净水3μL，构建逆转录反应混合物体系10μL，在每管10μL基因组DNA去除反应物中加入10μL逆转录反应混合物，混匀，42℃15min，马上放入95℃保持15min中断反应，每个反应中加入91μL RNA-free水，混匀，把反应放在冰上继续之后的实时PCR实验过程。

4. 实时PCR（聚合酶链式反应）：按RT² SYBR Green ROX qPCR Mastermix说明步骤准备PCR反应混合物，在5mL试剂管中加入2×RT² SYBR Green Mastermix 1350μL，cDNA合成反应物102μL，无RNA酶纯净水1248μL。从密封的包装袋中取出RT2Profi ler PCR Array Human Growth Factors，向其每一孔加入25μL PCR反应混合物，并用透光粘性密封膜密封，室温离心1min，1 000×g，离心去除气泡。将RT2Profi ler PCR Array放入PCR仪进行PCR实验，95℃预变性10min，激活HotStart DNA Taq Polymerase，95℃变性15s，40个循环，收集荧光数据。

5. 用PCR仪的程序计算循环数阈值（CT），把所有孔的CT值输入至Excel页面，利用www. SABioscience.com/pcrarraydataanalysis.php的PCR-array数据分析软件，使用∆∆ CT方法进行数据分析，将所得数据转化为相对基因表达结果。

6.热图分析（heatmap）：在网页http：// pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php中， 按网页操作说明制作聚类热图。

结　果

一、人前列腺癌细胞系PPCC--33和PC-33--AARR++体外培养

常规培养人AR全长cDNA质粒稳定转染建立AR再表达人前列腺癌细胞系PC-3-AR+和AR阴性PC-3细胞系［7］，见图1。

图1　PC-33和PC-33--AARR++细胞形态图A为PC-3；B为PC-3-AR+

二、人前列腺癌细胞系PC-3和PC-3-AR+总RNA样品的定量和质控结果

RNA样品的浓度和纯度比可以用分光光度计的吸光度来测定，在260nm波长并且检测路径为1cm时，吸光度1.0相当于RNA浓度为40μg/mL，对于RNA样品，A260：A280须在1.8到2.1之间，A260测出的浓度须大于40μg/mL（表1）。之后我们做了RNA电泳，对RNA样品进行质量控制，电泳图（图2）显示可见，28S、18S条带比例较好，5S条带较弱。

三、人前列腺癌细胞系PPCC--33和PC-33--AARR++生长因子相关基因族的表达差异

为比较两株细胞系PC-3-AR+和PC-3中生长因子相关基因的表达差异，我们采用了PCR-array技术，利用德国Qiagen公司的RT² Profi ler™ PCR Array Human Growth Factors板对两株细胞系的生长因子相关基因表达量进行相对定量分析。RT² Profiler™PCR Array Human Growth Factors盘包括84个生长因子相关基因和5个看家基因的PCR检测引物、1个基因组DNA污染质控、3个逆转录质控及3个PCR反应质控。在进行实时荧光PCR后，我们得到两株细胞，每株3次平行的扩增曲线；利用PCR-array数据分析软件，使用∆∆ CT方法进行数据分析，将所得数据转化为相对基因表达结果，之后我们根据96孔板的基因分布做了相应的3D柱状图（图3），直观地反映各个基因在两株细胞系中的差异表达。实验结果显示，两株细胞中绝大部分基因的表达量均具有差异性，其中FGF13、IGF2、CSF2、CXCL1等基因差异倍数超过5倍以上（表2），且差异具有明显显著性（P＜0.01）。

表11　RRNNAA样品定量结果

图22　 RRNNAA电泳图

表22　PC-3-AR+ vs PCC--33基因表达显著差异列表

四、人前列腺癌细胞系PPCC--33和PC-33--AARR++生长因子相关基因族表达差异的热图分析

我们进一步应用聚类热图分析，比较两株人前列腺癌细胞系PC-3和PC-3-AR+中生长因子相关基因族的表达差异，结果如图4所示。聚类热图可以直观地呈现两株细胞系PC-3和PC-3-AR+多个基因的全局表达量变化，还可以呈现多基因表达量的聚类关系。从图4中可以看出每个基因在两株细胞中的表达量有明显差异。通过对基因聚类，可以看出基因间聚类的远近关系。

图33　PCR-aarrrraayy结果图

图44　PCR-arrrraayy 聚类热图

讨　论

目前，前列腺癌的发病原因与发病机制尚不清楚，前列腺癌的高发人群集中在老年人，年龄越大发病率越高，中年人发病少见，青年人几乎不发病。有研究发现，睾丸不发育或没有睾丸的人不发生前列腺肥大，也不发生前列腺癌，说明前列腺癌的发生与雄激素（androgens）有着密切的关系。

人前列腺癌具有雄激素依赖型和非依赖型两种，雄激素依赖型前列腺癌进展为雄激素非依赖型，即CRPC后，尚无有效的治疗方案，预后极差，生存期缩短。CRPC的发生机制极为复杂，AR基因的扩增、丢失和（或）突变，会直接影响CRPC的发生和发展［12-15］。

正常前列腺组织中，雄激素与AR作用，通过自分泌或旁分泌途径，可调控生长因子的表达和分泌，间接调控前列腺细胞的生长和发育。而PCa发生后，尤其是进展为CRPC后，AR表达异常，导致内分泌功能紊乱，造成下游各种生长因子及其受体表达异常，细胞增殖和凋亡功能失衡，从而促进PCa的发展及内分泌治疗的失败。前列腺癌的发生和发展受雄激素、AR和各种生长因子及其受体的共同作用。

PC-3细胞为雄激素非依赖型人进展期前列腺癌细胞系，AR表达阴性。PC-3-AR+细胞系为John T. Isaacs教授［11］领导的实验室应用人全长AR cDNA质粒转染PC-3细胞而建立，AR表达为强阳性。我们已完成的研究表明，AR对人前列腺癌细胞的肿瘤生物学特性有重要影响作用，人前列腺癌细胞中再表达AR，可以使癌细胞生长能力减弱，增殖和迁移能力受抑制，并可降低体内移植瘤的成瘤率、成瘤体积和浸润能力等［7］。本研究中，我们进一步应用PCR芯片技术（PCR-array），对比性研究AR cDNA再表达人前列腺癌细胞系PC-3-AR+与AR阴性的人前列腺癌细胞系PC-3中生长因子相关基因族的表达差异，探讨人前列腺癌细胞AR与生长因子信号通路的相关性。

人生长因子信号通路PCR-array检测结果显示，两株细胞中绝大部分基因的表达量均具有差异性，其中FGF13、IGF2、CSF2、CXCL1等基因的表达差异倍数超过5倍以上，具有显著性差异（P ＜0.01）。生长因子在胚胎发育、伤痕愈合、炎症等多种生理过程中起着重要的作用。The Human Growth Factors RT² Profiler™ PCR Array涉及生长因子相关基因84个，包括血管生成生长因子、凋亡调节因子、调节细胞分化因子等基因。有研究表明，成纤维生长因子（fi broblast growth factors， FGF）可以调节细胞分化和迁移，在前列腺癌的发生发展中起着重要作用［16］；集落刺激因子（colony stimulating factor， CSF）对不同发育阶段的造血干细胞起促增殖、分化的作用，是血细胞发生必不可少的刺激因子，集落刺激因子还可以促进癌细胞在血液中的运行，作用于肿瘤微环境，积极参与前列腺癌的发生和转移［17］。从表2可以看出，集落刺激因子CSF2在PC-3-AR+中的表达显著降低；趋化因子CXCL1也显著降低。Chemokine（C-X-C motif）ligand 1（CXCL1）是趋化因子（chemokine）CXC亚家族的成员，CXCL1可以通过加强肿瘤组织上皮和间质间相互作用从而加快肿瘤生长和侵袭［18］。趋化因子CXCL1在多种肿瘤的生长、增殖、转移和侵袭以及血管新生中起重要调节作用。AR再表达能够改变人前列腺癌细胞系PC-3中生长因子相关基因族的表达，人前列腺癌中AR与生长因子信号途径的表达具有显著相关性。

根据生长因子PCR-array的实验结果，我们会进一步研究AR同CSF、CXCL1等基因之间的关系，阐明AR对这些重要生长因子基因族表达的影响及其与前列腺癌干细胞分化和肿瘤生物学特性的关系，为临床预防和治疗前列腺癌特别是CRPC提供新的靶点和思路。

参 考 文 献

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（2016-02-18收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.001

中图分类号R 737.25*基金项目资助：本研究课题受国家自然科学基金（NSFC）面上项目（项目批准号：81372772）、江苏特聘教授科研基金（苏教师［2012］34号）、南通大学研究生科技创新计划项目（项目编号：YKC14054）和江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）资助

Re-expression of androgen receptor（AR） in human prostate cancer cell line PC-3 affects expression patterns of the cluster of growth factor-related genes*

Cao Jingchen1， Zhang Chong1， Wang Haiyan1， Zhang Yonghui1，Chen Miaomiao1，Lv Xiufang1， E Qun1， 2， Liu Xin3， Jiang Ming1**
1.Laboratory of Nuclear Receptors and Cancer Research， Center for Basic Medical Research， Nantong University School of Medicine， Nantong 226001， Jiangsu， China. 2.Department of Pathology， Nantong University School of Medicine. 3.Department of Urology， Jingjiang People’s Hospital Corresponding author： Jiang Ming， E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn

AbstractObjectiveTo investigate the different expressions of growth factor-related genes between human prostate cancer cells PC-3 and PC-3-AR+ with androgen receptor （AR） re-expressed and discuss the relationship between AR and the signal pathways of growth factors. MetthhooddssThe different expressions of growth factor-related genes between in human prostate cancer cell lines PC-3 and in PC-3-AR+ were measured by RT² Profiler™ PCR Array Human Growth Factors（Qiagen， Germany）. RessuullttssDifferent expressions of some growth factor-related genes were identified between in human prostate cancer cell lines PC-3 and in PC-3-AR+， such as FGF13， ERAP1， IGF2， CSF2 and CXCL1 genes （P＜0.01）. ConcluussiioonnThe re-expression of full-length AR cDNA in human prostate cancer cell line PC-3 may influence the expression levels of growth factor-related genes， indicating that AR may be related to the signal pathways of growth factors in prostate cancer cells.

Key wordsprostatic neoplasms；receptors， androgen；growth factors

**通讯作者，E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn